Medidas solo de liposomas para el estudio de enzimas de membrana bombas de protones usando electroquímica y microscopia fluorescente

Información sobre mecanismos de enzimas y cinética se obtiene generalmente en el nivel de conjunto o de macroescala con población de enzima en los miles de millones de moléculas, donde las mediciones representan un promedio estadístico. Se sabe, sin embargo, que macromoléculas complejas como las enzimas pueden demostrar heterogeneidad en su comportamiento y mecanismos moleculares observados a nivel de conjunto no son necesariamente válidos para cada molécula. Tales desviaciones en la escala de la molécula individual han sido ampliamente confirmados por estudios de enzimas individuales con una variedad de métodos emergentes durante el último dos décadas¹. En particular, detección de la fluorescencia de la actividad enzimática individuales se ha utilizado para investigar la heterogeneidad de la actividad de enzimas^2,3 o descubrir el efecto de memoria supuesto (períodos de actividad de las enzimas altas por periodos de baja actividad y viceversa)^4,5.

Muchos estudios de la enzima solo requieren que las enzimas son inmovilizadas sobre la superficie o espacial fija de otra manera permanecer suficientemente largo en el campo de visión para la observación continua. Encapsulación de enzima en liposomas se ha demostrado para permitir la inmovilización de la enzima al tiempo que evita cualquier impacto negativo por la superficie enzimas o proteínas interacciones^6,7. Además, liposomas ofrecen una posibilidad única para el estudio de proteínas de la membrana solo en sus lípidos naturales bicapa entorno^8,9,10.

Una clase de proteínas de membrana, transportadores, ejerce un desplazamiento direccional de sustancias a través de la membrana celular, un comportamiento que sólo puede ser estudiada cuando las proteínas se reconstituyen en el lípido bicapas (por ejemplo, liposomas)^{11, 12,13}. Por ejemplo, translocación de protones, expuesto por varias enzimas de cadenas de transporte del electrón de prokaryotic y eukaryotic, desempeña un papel importante en la respiración celular, mediante la creación de una fuerza protón-motriz utilizada para la síntesis de ATP. En este caso, la actividad de bombeo de protones está acoplado a la transferencia de electrones, aunque el mecanismo detallado de este proceso a menudo sigue siendo elusivo.

Recientemente, hemos demostrado la posibilidad de detección fluorescente par con electroquímica para el estudio de actividad de las enzimas individuales de la oxidasa terminal ubiquinol de Escherichia coli (citocromo bo₃) de bombeo de protones reconstituida en liposomas¹⁴. Esto se logró mediante la encapsulación de un colorante fluorescente impermeable membrana sensible al pH en el lumen de liposomas preparados a partir de E. coli lípidos polares (figura 1A). La cantidad de proteína fue optimizada para que liposomas mayoría tampoco contienen ninguna o solamente una molécula de enzima reconstituido (según la distribución de Poisson). Los dos sustratos de citocromo bo₃ fueron proporcionados mediante la adición de ubiquinona a la mezcla de lípidos que forman los liposomas y el oxígeno (ambiente) en solución. Los liposomas son entonces escasamente fijado por adsorción en un electrodo de oro ultra suave semitransparente, cubierto con una monocapa uno mismo-montado de 6-mercaptohexanol. Finalmente, el electrodo se monta en la parte inferior de una celda electroquímicas simple (figura 1B). Control electroquímico del estado redox quinona piscina permite una flexible activar o detener la reacción enzimática en cualquier momento, mientras que el tinte pH-sensible se utiliza para monitorear cambios en el pH dentro del lumen de los liposomas como resultado de la translocación de protones por el enzimas. Por utilizar que se puede determinar la intensidad de fluorescencia de un colorante fluorescente en segundo lugar, enlazados a lípidos, el tamaño y el volumen de los liposomas y la cuantificación de protones enzima actividad de bombeo. Usando esta técnica, en particular encontramos que citocromo bo₃ moléculas son capaces de entrar en un estado de escape espontáneo que rápidamente se disipa la fuerza motriz protónica. El objetivo de este artículo es presentar la técnica de mediciones solo liposomas en detalle.