Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Informatie over Enzymmechanismen en kinetiek, wordt meestal opgehaald op het niveau van het ensemble of situering met enzym bevolking in duizenden tot miljoenen van moleculen, waarbij de metingen een statistisch gemiddelde vertegenwoordigen. Het is echter bekend dat complexe macromoleculen zoals enzymen heterogeniteit in hun gedrag aantonen kunnen en moleculaire mechanismen waargenomen op het ensemble-niveau niet noodzakelijkerwijs geldig voor elke molecuul zijn. Dergelijke afwijkingen op de schaal van de individuele molecuul werden uitgebreid bevestigd door studies van enkele enzymen met een verscheidenheid van methoden die zijn ontstaan tijdens de laatste twee decennia¹. Met name, is fluorescentie detectie van individuele enzymactiviteit gebruikt voor het onderzoeken van heterogeniteit van^2,3 van de activiteit van de enzymen of ontdek het zogenaamde geheugeneffect (periodes van hoge enzymen activiteit opgevolgd door periodes van lage activiteit en vice versa)^4,5.

Veel één enzym studies vereisen dat de enzymen worden geïmmobiliseerd op de oppervlakte of ruimtelijk vast op een andere manier te blijven lang genoeg in het gezichtsveld voor de continue waarneming. Enzym inkapseling in liposomen is aangetoond dat het enzym immobilisatie terwijl het voorkomen van eventuele negatieve gevolgen vanwege de oppervlak-enzym of eiwit-eiwit interacties^6,7inschakelen. Daarnaast, bieden liposomen een unieke mogelijkheid om te studeren één membraaneiwitten in hun natuurlijke lipide dubbelgelaagde milieu^8,9,10.

Een klasse van membraaneiwitten, vervoerders, oefent een directionele translocatie van stoffen tussen de celmembranen, een probleem dat alleen kan worden bestudeerd wanneer eiwitten worden aangemaakt in de lipide bilayers (b.v., liposomen)^{11, 12,},¹³. Bijvoorbeeld, speelt proton translocatie, tentoongesteld door verschillende enzymen van prokaryote en eukaryote electron vervoersketens, een belangrijke rol in de cellulaire ademhaling door het creëren van een proton-stuwende kracht gebruikt voor ATP-synthese. In dit geval is het proton pompen van de activiteit gekoppeld aan de overdracht van het elektron, hoewel de gedetailleerde mechanisme van dit proces vaak ongrijpbaar blijft.

Onlangs, we de mogelijkheid om paar TL detectie met elektrochemie te bestuderen van proton pompen activiteit van enkele enzymen van de terminal ubiquinol oxidase van Escherichia coli (cytochroom bo₃) aangetoond gereconstitueerd in de liposomen¹⁴. Dit werd bereikt door de inkapseling van een pH-gevoelige membraan-ondoordringbare fluorescente kleurstof in het lumen van de liposomen bereid uit E. coli polar lipiden (figuur 1A). Het bedrag van de eiwitten is geoptimaliseerd zodat de meeste liposomen ofwel geen of slechts één gereconstitueerde enzym molecuul (volgens de Poisson-verdeling bevatte). De twee substraten voor cytochroom bo₃ werden verstrekt door ubiquinone toe te voegen aan de mix van lipide dat de liposomen en (omgevingstemperatuur) zuurstof gevormd in oplossing. De liposomen zijn dan dun geadsorbeerde op een semi-transparante ultrasoepel gouden elektrode, bedekt met een zelf samengestelde enkelgelaagde van 6-mercaptohexanol. Tot slot, de elektrode is gemonteerd op de onderkant van de cel van een eenvoudige spectroelectrochemical (figuur 1B). Elektrochemische controle van de Chinon zwembad redox staat maakt het mogelijk een flexibel starten of stoppen van de enzymatische reactie op elk moment, terwijl de pH-gevoelige kleurstof gebruikt voor het bewaken van pH veranderingen binnen het lumen van de liposomen als gevolg van proton translocatie door de enzymen. Met behulp van die de intensiteit van de fluorescentie van een tweede, lipide-gebonden fluorescente kleurstof, de grootte en het volume van de afzonderlijke liposomen kan worden bepaald en dus de kwantificering van enzym proton pompen activiteit. Met behulp van deze techniek, vonden met name wij dat cytochroom bo₃ moleculen om te gaan met een spontane lek staat die snel de proton motive force verdwijnt. Het doel van dit artikel is voor het omschakelen techniek van één liposoom metingen in detail.