Colletotrichum fioriniae 물, 클로 프롬 기반 블루베리와 크랜베리 꽃 추출 물 개발
Summary
여기, 생물 검정 곰 팡이 병원 체의, Colletotrichum fioriniae, 유리 coverslips에 블루베리 나 크 렌 베리 꽃 추출의 개발을 모니터링 하도록 설계 된 설명 합니다. 물, 클로 프롬 및 필드 빗 물-꽃 추출 기술을 어떻게이 정보를 적용할 수 있습니다에 대 한 통찰력 뿐만 아니라 자세한 위치를 기반으로 합니다.
Abstract
피는 기간의 기후학 및 병원 체 썩 어 곰 팡이 과일에 꽃 화학 신호의 시간적 역학을 정확 하 게 모니터링 하려면 꽃 추출 방법 및 coverslip 생물 검정 개발 되었다 Colletotrichum fioriniae를 활용 하 여. 블루베리와 크랜베리,이 병원 체 감염의 초기 단계에서 역할 꽃 놀이 때문에 피는 기간 동안 살 균 제를 적용 하 여 최적으로 제어 됩니다. 여기서 설명 하는 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 꽃 추출 물 (FE) 해당 유리 coverslip 생물 검정에서 나중에 사용할 물, 클로 프롬 및 필드 빗 물 기반 메서드를 사용 하 여 얻은 했다. 다양 한 정보를 제공 하기 위해 각 철 봉사: C. fioriniae 의 동원된 꽃 화학 반응 물 (물 기반), 꽃 및 과일 표면 왁 스 (클로 프롬 기반), 및 필드 기반 모니터링의 병원 체 응답 신호 생체 외에서 관찰 한 농업 설정 이동 꽃 빗 물 수집. FE는 광범위 하 게 설명으로 어느 물 또는 클로 프롬-기반,이 두 재료 사이의 고유의 차이 대 한 보상을 설명 하는 적절 한 검정을 합니다. 꽃에서 실행 했다 빗 물 각 작물에 대 한 독특한 장치에서 수집 된 유연성과이 이렇게 다른 자르기 시스템의 응용 프로그램을 암시 했다. 생물 검정 신속, 저렴, 간단 하 고 다양 한 소스에서 물질로 꽃 화합물의 존재에 대 한 사이트별 spatiotemporal 정보를 생성 하는 기능을 제공. 이 정보 알릴 것 이다 궁극적으로 더 나은 질병 관리 전략, FE 감염 발생에 필요한 시간을 줄이기로 성장 하는 시즌 동안 병원 체 감염에 대 한 위험을 변경에 대 한 통찰력을 제공.
Introduction
Colletotrichum fioriniae Highbush 블루베리 (Vaccinium corymbosum L.), 큰 미국 적갈색 (macrocarpon V. Aiton)1,2의 과일 썩 음을 발생합니다. 이 병원 체는 C. acutatum 종3,4,,56 에서 최근 delineated 했다 고 블루베리 탄의 원인 요원과 회원이 크랜베리 과일 부패의 복잡, 수많은 다른 식물 질병 전세계7발생 뿐만 아니라. C. fioriniae 하지 명백한 되는 과일 성숙9의 최종 단계에서 때까지 꽃과 증상 개발 중 발생 하는 감염 한 잠재성, hemibiotrophic 라이프 스타일8, 있다. 블루베리와 크랜베리, 과일 부패 균 응용 프로그램 피는 기간 동안만 적절 하 게 제어 됩니다. 병원 체는 휴면 블루베리 꽃 봉 오리 비늘10 overwinters 하 고 꽃 중 sporulates. Conidia는 비가 시작 분산11,12 통해 캐노피를 통해 이동 하 고 inoculum 증강을 강력 하 게 꽃 기간13에 상관 되었다. 꽃은 감귤 류의 게시물 꽃 과일의 구성 요소 드롭 (PFD)14 뿐만 아니라 딸기 탄15, 두 경우 모두 일으키는 중요 한 호스트 꽃 Colletotrichum 종의 응답 Vaccinium에 고유 하지 않습니다. 병원 체를 sporulate입니다. 이러한 모든 경우 C. fioriniae 과 꽃 동안 감염 기타 병원 균에 꽃 화학 신호의 시간적 역학을 평가 하는 효과적인 방법에 대 한 필요성을 강조. 여기에 설명 된 방법으로 제공 하는 통찰력 점점 더 귀중 한 되 고 있다.
이 프로토콜 꽃 추출 (FE) 조달의 방법 하 고 유리 coverslip 생물 검정15,16을 통해 철에 대 한 C. fioriniae 응답 평가 안내. 꽃 추출 기법은 두 개의 주요 유형; 나뉩니다. 물 추출 (액티브-FE, 수동 (패스-FE), 및 필드 빗 물 기반 (rw-FE)), 그리고 클로 프롬 기반 (ch-FE)17 기사. 물 추출 물 동원 꽃 화학 단서의 검사에 대 한 수 있습니다. 이 동원된 신호 철 크게 감염16, 감염 발생에 필요한 습기를 제공 하는 속도 증가 때문에 감염의 가능성이 중요 한 구성 요소는. 또한, 그들은 꽃 자극 일로-이벤트 이전 블루베리와 다른 자르기 시스템14,16에 관찰로 중 캐노피 내내 세척 될 수 있다로 더 자연 스러운 상태를 나타냅니다. 클로 프롬 기반 꽃 기사 (ch-FE)도 호스트 표면에 병원 체 응답에 관한 귀중 한 정보17,18, conidia 취약에 입금 한 번의 초기 성장 단계를 elucidating 왁 스 제공 호스트 기관 (즉, 꽃, 난소 및 개발 과일). 병원 체 계절의 변화에 대응 호스트 표면 왁 스에도이 프로토콜을 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 따라서, 생물 검정 물 기반 FE 또는 클로 프롬 기반 FE이 두 재료 사이의 고유의 차이 완화 하기 위해 협력을 맞게 조정 됩니다.
생물 검정에서 생성 된 데이터 추출 물-기반 보조 conidiation 클로 프롬 기반 기사 보다 높은 수준의 자극 밝혀 최종 appressorial 응답 되었다, 따라서 여러 화합물 연루 철에. 흥미롭게도, 이러한 성장 반응의 둘 다 때 여러 stimulatory 화합물을 나타내는 블루베리와 크랜베리 꽃에서 실행 했다 빗 물을 사용 하 여 세척 될 수 있다 꽃의 표면에서 관찰 되었다. 따라서, 꽃 자극에 대 한 모니터링 농업 시스템에서 병원 체 성공의 확률에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.
이 프로토콜의 궁극적인 목표에 도움이 꽃이 정보를 사용할 수 있는 시작 방법론 꽃 화학 신호에 대 한 응답에서 버섯 모양 식물 병원 체에 생성 초기 생물 정보에 대 한 방법론을 제공 하는 사이트별 질병 관리 및 의사 결정 프로세스입니다.
Protocol
1. 균 분리 및 포자 현 탁 액 자연적으로 감염 된 호스트19 Colletotrichum fioriniae 를 격리 합니다. 그런 다음, 옥수수 식사 agar (CMA) 글씨의 기울기에 깨끗 한 문화를 저장. 표준 플라스틱 셀 문화 접시 (지름 9 c m)를 포함 하는 하나 명확히 V8 주스 한 천 (cV8A) (밀러에서 수정), 또는 비 명확히 V8 주스 한 (V8A)20에 (에서 CMA 경사) 문화의 플러그를 놓습니다. 식민지는 sporulate를 시작, conidia (오렌지 conidial 대 중) 다른 cV8A 또는 V8A에 행진 (표준 메 마른 루프)와 셀 문화 접시를 포함 하는 고밀도 sporulating 문화를 생산 하.참고: 균 류와 어떤 프로토콜 단계 오염 곰 팡이 문화 및 생물 검정의 가능성을 줄이기 위해 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다. 후의 성장, 표준 메 마른 루프를 사용 하 여 7 일 (만져 가볍게 conidial 질량에 루프) 고밀도 문화에서 conidia의 작은 금액을 수집 하 고 살 균 이온을 제거 된 물 (SDW) 10 mL를 포함 하는 15 mL 원심 분리기 관으로 이것을 저 어. 소용돌이이 샘플 10 s, 다음 표준 피 펫을 사용 하 여 잠수를 위아래로 여러 번 더 믹스 샘플. 그런 다음는 hemocytometer에 vortexed 샘플 한 방울 놓고 포자 농도 추정 합니다. 수 5-10 필드는 hemocytometer에 평균, 가져오고 적절 한 희석 비율 (예: 10000), 평균을 곱하면 따라서 mL SDW 당 conidial 농도 얻기. 다음 볼륨 (V)를 사용 하 여 / 농도 (C) 방정식 (V1● [1C] = V2● [C2]) 5 mL 최종 볼륨 SDW의 mL 당 105 conidia X 1.0 (SDW)와 조정. 이 포자 현 탁 액 이라고 하 고만 즉시 어느 생물 검정에 사용 하기 전에 이루어집니다. 2. 활성, 꽃 추출 물 (활성 -FE)15,16 참고: 보충 그림 1, 그림 2 보충, 보충 그림 3및 보충 영화 1참조. 신중 하 게 손을-블루베리 (4 월-5 월)와 크랜베리 (6 월-7 월) 꽃 동안 수집 분야 (보충 그림 1)에서 그들의 각각 피크 꽃. 착용 하 고 니트 릴 장갑 인간의 피부 기름 오염 억제 하 고 오염 꽃 종류 사이 크로스 샘플링 위치 (cultivars/품종/물리적 위치) 변경. 비닐 봉지 (100 x 150 mm 가방 채우기)에 블루베리 또는 적갈색 꽃 (단일 소스)를 놓고 꽃 수집 즉시 4 ° C에서 냉장 보관 합니다.참고: 액티브 추출 레안드로 외에서 수정 됩니다. (2003) 16. 이전 추출, 어떤 악화, 손상, 질병 꽃 다음 건강 한 꽃을 사용 하 여 곡선된 겸 자 (45˚ 족집게)으로 난소, sepals 및 peduncles를 제거 하 고 삭제. 만 나머지 장기 (코 롤라, 오명, 스타일과 오시)를 사용 하 여 활성- 기사에 대 한. 투박한 (150 x 150 mm)와 7 x 7 mm 퍼 널 내에서 장소, 깨끗 한 50 mL 원심 분리기 관으로 장소 잘라내어 따로 설정. 1 결합 부분 처리 9 부품 SDW 꽃 (1 wt: 9 권 비율)는 박격포에서. 부드럽게 갈아 30 유 봉과 s (샘플을 완전히 격파 하 돌). 준비 된 투박한/퍼 널을 통해 결과 펄프를 변형 하 고 원심 분리기 튜브 (50 mL)에 수집 합니다. 청소 또는 95 %EtOH 각 추출 및 따뜻한 흐르는 물 사이 새로운 박격포/유 봉을 사용 합니다. 진공 여과 장치를 준비: 부 흐 너 깔때기, 진공 필터 삼각 플라스 크 (최대 1000 mL 용량), 55 m m 원형 필터 종이, 및 진공 호스/소스 수집. 적절 한 크기의 부 흐 너 깔때기에 종이 필터를 추가 및 플라스 크, 위에 다음 물에 장치를 연결 / 소스 진공 호스를 통해 흡입 놓고 따로 설정 합니다. 더 8,055 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여 블루베리 꽃 추출 물을 명확 하 게. 준비 된 진공 필터 장치에 상쾌한 떨어져 따르십시오, 진공 소스 설정, 상쾌한, 필터 다음 플라스 크 내용을 새로운 분리기 관 (50 mL)에 부 어. 각 여과 95 %EtOH 따뜻한 흐르는 물 사이 모든 장치 부품을 청소. 주사기를 통해 추가 필터는 0.22 µ m 기 공 크기, 살 균, 초 산 새 원심 분리기 튜브 (50 mL)에 필터와 적응. 크랜베리 꽃 추출 물, 유일한 진공 필터 종이 통해 필터링 및 플라스 크 내용을 새로운 분리기 관 (50 mL)에 부 어. 결과 준비 활성-꽃 추출 물 (액티브-FE)으로 불린다. 실험적인 사용까지 5-50 mL aliquots에-20 ° C에서 모든 물-기반 꽃 추출 물 (액티브- 패시브-, 빗 물 모음)를 저장 합니다. 여러 샘플 (샘플 유형 당 적어도 3 기사) 기사를 반복 하 여 복제를 제공 하. 3. 수동 , 꽃 추출 물 ( 통과 -FE) 16 참고: 추가 영화 2 Hand 수집 전체 블루베리 꽃 (50 g) 이상으로 하 고 수집 후 냉장 보관. 이전 추출, 꽃이 악화, 손상, 질병을 제거 하 고 그대로 꽃에서 peduncles만을 제거 합니다. 아래에 설명 된 수동- 추출 시스템은 장소에까지 준비 된 샘플을 냉동. 린스 (플라스틱 메쉬 시트, 2 개의 플라스틱 메쉬 바구니, 유리 빵 팬 및 펌프 안개 병) 오염을 방지 하기 위해 95% 에탄올 (EtOH)와 따뜻한 실행 물으로 사용 하 여 모든 구성 요소 사전. 또한 각 (2.2 단계)에서 위에서 설명한 대로 추출 및 세트 옆으로 대 한 4 레이어 투박한/깔때기/50 mL 원심 분리기 튜브를 준비 합니다. 체 준비: 플라스틱 메쉬 시트 (일명 매트 바 분명) 한 플라스틱 메쉬 바구니 (114 x 102 m m)에 배치. 두 번째, 동일, 메쉬 바구니를 거꾸로 배치 (반전) ()을 피하기 위해 SDW에 앉아 꽃 빵-팬 (127 x 229 mm) 유리 및 장소에는 메쉬 시트 위에 있는 바구니. 체에 준비 된 꽃의 50 g을 추가 합니다.참고: 또는, 작은 테스트 튜브 [정화] 바구니 사용할 수 있습니다 (, 녹색, 딸기 메쉬 파인트 바구니 들은 소스 어렵다) 원래 사용된 플라스틱 메쉬 바구니 대신. 균등 하 게 250 mL는 펌프를 사용 하 여 안개 꽃 안개 병 고 유리 빵 팬에 결선. 다음 깨끗 한 원심 분리기 관으로 여과 액 준비 투박한/퍼 널을 통해 변형. 결과 준비 라고 수동-꽃 추출 (패스-FE); (2.6 단계) 위의 당으로 저장 합니다. 95 %EtOH 각 추출 및 따뜻한 흐르는 물 사이 모든 구성 요소를 청소. 여러 샘플 (샘플 유형 당 적어도 3) 복제를 제공 하는 기사를 반복 합니다. 4. 클로 프롬-기반 꽃 추출 물 (ch-FE) 17 (2.1), 단계 위의 당으로 블루베리와 크랜베리 꽃을 수집 하 고 꽃 추출 (단계 2.2, 투박한/퍼 널 준비 없이)에 대 한 준비. 준비 된 꽃을 사용 하기 전에 때까지 냉장 하십시오. 클로 프롬으로 수행 된 모든 작업은 안전 상의 이유로 연기 후드에서 수행 되어야 합니다. 이 재료의 준비를 포함 / 유리, 추출 절차 및 검정 계수 (ch-FE를 사용 하 여 단계). 95% 모든 부품 청소 EtOH 두 번, 다음 두 번 각 추출에 대 한 오염을 방지 하기 위해 클로 프롬과: 유리 문화 관, 2 유리 비 커, 작은 스테인레스 스틸 스크린과 [유리] 대학원 실린더 스레드. 거꾸로 건조를 따로 설정 합니다. 소계 (PTFE) 줄지어 모자 95로 두 번 린스 %EtOH (클로 프롬 뚜껑의 외부 자료를 손상 할 것 이다)와 건조 따로 설정. 1 결합 부분 처리 9 부품 클로 프롬에 꽃 (1 wt: 9 권 비율) 비 커에 (꽃 다음 클로 프롬), 부드럽게 30 s, 그리고 두 번째 비 커에 스테인레스 스틸 화면을 통해 긴장에 대 한 소용돌이. 유리 문화 관 (10-15 mL)에 두 번째 비 커에서 ch-FE를 부 어 및 PTFE 캡 부착. 증발을 방지 하기 위해 parafilm으로 모자를 바꿈. 이 준비는 클로 프롬 기반 꽃 추출 물 (ch-FE) 이다. 어둠 (라이트 저하를 줄이기 위해) 4 ° C에서 실험 사용까지 샘플을 저장 합니다. 여러 샘플 (샘플 유형 당 적어도 3) 복제를 제공 하는 기사를 반복 합니다. 5. 블루베리 꽃 (BB rw-FE)16 에서 빗 물 수집 참고: 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치 구성 연결 어댑터에 대 한 공기 스프레이 총 일회용 페인트 스프레이 컵 (컵: 여성 스레드, 어댑터: 남성 남성 스레드), 50 mL 원심 분리기 관 (폴 리 프로필 렌), parafilm, 및 플라스틱 코팅된 전선 ( 표준 전화 와이어, 개별 내부 와이어 스트랜드 내용). 빗 물 수집 장치를 만들기 전에 꽃의 실행을 잡으려고 블루베리 부시 내에서 여러 위치를 선택 합니다. 바로 아래 inflorescences (꽃) 부시 (크라운)의 아주 기본에 포함 됩니다. 줄기 (1-5 cm에서 배열 하는)이 선택 된 위치에서의 레코드 직경 장치 첨부 파일, 아래에 설명 된 사용 하는 구멍의 크기를 쓰게 됩니다. 각 선택 된 위치에 대 한 수집 장치를 만듭니다. 먼저 단계 비트 드릴 프레스에 연결 된 해당 줄기 직경 스프레이 컵 (여기서 컵 스레드 오프닝으로 곡선)의 하단에 구멍을 드릴 합니다. 그런 다음 스프레이 컵의 입에 thehole의 상단에서 직선 절단. 스프레이 컵의 입에 (충분히 큰 플라스틱 코팅 된 와이어로), 4 동일한 구멍을 드릴 하 고 한쪽 무료 떠나 플라스틱 코팅된 전선의 한쪽 끝. 충분히 큰 50 mL 원심 분리기 캡 뚜껑으로 페인트 분무기 컵 어댑터 스레드 구멍을 드릴 합니다. 어댑터 스레드 누수 방지 하기 위해 parafilm으로 밀봉. 이 원심 분리기 모자 및 분무기 컵의 뚫린된 부분을 연결 합니다. 성관계 50 mL 원심 분리기 튜브를 연결 합니다. 5.3 5.4 생성 단계를 선택한 위치, 샘플링 위치 당 4 수집 장치의 최소 당 여러 개의 장치를 반복 합니다. 줄기에 맞게 분무기 컵을 flexing 하 여 선택한 위치에 장치를 배포 합니다. 동양 (막으려고 꽃 위에 통과 하는 물 캡처) 다른 줄기에 부착 된 플라스틱 코팅 된 와이어를 사용 하 여 위쪽으로 스프레이 컵의 자르 측. 부착 parafilm 빗 물 누수 수 모든 구멍. (보충 그림 3, 보충 그림 4, 그림 5 보충, 그리고 보충 그림 6). 레이블 컬렉션 튜브 배포 날짜 / 시간. 비 이벤트 후 제거 하 고 원심 분리기 튜브의 아래쪽 (튜브) 부분을 교체 (날짜를 라벨 / 컬렉션의 시간). 내부 결선 컬렉션 (블루베리 빗 물 꽃 추출 물 (BB rw-FE) 라고 함)를 지참 하 고 진공 필터 (여과 단계 2.4-2.5에서 설명). (단계 2.6), 위에 매장 물 기반 생물 검정에 사용 될 때까지. 6. 적갈색 꽃 (CB rw-FE)에서 빗 물 수집 적갈색의 꽃 빗 물 수집 장치는 7 X 7 cm 폴 리 프로필 렌 퍼 널, 50 mL 원심 분리기 튜브 (폴 리 프로필 렌), parafilm, 이루어져 있고 4 표준, 플라스틱 코팅 트위스트 관계 (장치당). 첫째, 열 찔린 금속 프로브를 사용 하 여 깔때기의 입 주위 8 등거리 구멍 (트위스트 관계의 직경) 합니다. 트위스트 관계 4 구멍에 삽입 합니다. 깔끔한 교차 패턴을 형성, 그 구멍의 반대 위치에 다른 끝을 연결할. 퍼 널 다운 줄기 parafilm으로 포장 하 고 따로 설정 합니다. 단계 조금 50 mL 원심 분리기 모자에 퍼 널 다운 줄기를 삽입에 충분히 큰 구멍을 드릴 합니다. 원심 분리기 모자에 준비 된 퍼 널을 삽입 합니다. 6.2-6.3 생성 단계를 여러 개의 장치, 4 수집 장치 샘플링 위치 당 최소를 반복 합니다. 선택 된 크랜베리 습지에 레이블된 (날짜/시간) 장치를 배포 합니다. 깔끔하게 두 꽃 베어링 inflorescences (uprights 라고도 함) 교차 플라스틱 트위스트 관계 아래 턱. 다음 세로로 크랜베리 캐노피 (보충 그림 7-8, 추가 동영상 3)으로 원심 분리기 튜브를 관통 하 여 장치 동양. 강우량 또는 오버 헤드 관개 후 제거 하 고 원심 분리기 튜브의 아래쪽 (튜브) 부분을 교체 (날짜를 라벨 / 컬렉션의 시간). 내부 결선 (크랜베리 빗 물 꽃 추출 (CB rw-FE) 라고 함)를 지참 하 고 진공 필터 (여과 단계 2.4-2.5에서 설명). (단계 2.6), 위에 매장 물 기반 생물 검정에 사용 될 때까지. 7. 검정 물 기반으로 꽃 추출15,16 를 사용 하 여 (액티브-FE, 통과-FE, rw-FE) 참고: 그림 1을 참조 하십시오. 이 생물은 층 류 두건에 준비가 되어 있습니다. 재료 준비: 트리플 린스 유리 coverslips 95 %EtOH 공기 건조, 다음 옆으로 넣어. 표준 플라스틱 셀 문화 요리 (9 cm)의 내부 직경을 종이 타 올 디스크를 잘라. 문화 요리 내 종이 디스크의 2 레이어를 배치 하 고 2 mL SDW와 함께 담가. 1.0 X 10의 5 mL 이상5 conidia SDW 포자 현 탁 액 (C. fioriniae) 당로 (단계 1.2-1.4), 위에서 mL 당 따로 준비 합니다. 다음으로, 동등한 양의 SDW 및 2 mL에 꽃 추출 물-기반 microcentrifuge 튜브 혼합. 그런 다음, 포자 현 탁 액의 같은 볼륨 준비 2 mL microcentrifuge 튜브 (SDW 플러스 FE);을 추가합니다 결과 준비는 수성 치료 혼합물 이라고 합니다. 컨트롤에 대 한 철 부분을 생략 하 고 SDW conidial 농도 일관성 유지를 바꿉니다.참고: 부분 크기 복제 및 시간-포인트의 수에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 일부는 500 µ L을 초과 하지 마십시오. Conidia와 FE 결합 생물 검정 시작 했다, 0 h 후 접종. 젖은 종이 수건 위에 미리 청소 유리 coverslips를 셀 문화 접시에 내 놓습니다. 수성 치료 혼합물의 40 µ L 드롭릿은 coverslip의 중심에 배치 합니다. 컨트롤을 포함 하 여 원하는 치료에 대 한 반복, 셀 문화 접시를 닫습니다. 복제 (적어도 3) 이며 시간 포인트 (각 접시 1 시간 포인트)에 대 한 별도 셀 문화 요리를 반복 합니다. 일단 모든 치료 및 복제 적절 되었습니다, 모든 복제 세포 문화 요리 밀폐 플라스틱 용기 (30 x 13 x 7mm)로 놓고 어둠 속에서 25 ° C에서 품 어. 미리 정해진된 시간 지점에서 성장을 중지 하는 작은 물방울에 10 µ L lactophenol 코 튼-블루 (20.0 g 페 놀 결정, 20.0 mL 2.5% 젖 산, 글리세롤 40.0 mL, 0.05 g 면 블루) 같은 정착 액의 추가 반 보존 및 마운트. 2 h이 유리 표면에 conidial 접착을 허용 하지만 conidial 발 아에 대 한 길이가 0 h 시간 포인트를 수집 하지 싶어. 다른 모든 시간 포인트에 대 한 해당 시간에 정착 액을 추가 합니다. 정착 액을 추가 경우 coverslips, 그들에 게 아래로 물방울 측면을 배치 현미경 검사 (슬라이드 당 1 coverslip) 촉진 하기 위하여 유리 현미경 슬라이드에 반전 하는 신중 하 게. 모든 coverslips에 있는 경우 유리 현미경 슬라이드, 두고 정착 하 고 20 분 동안 흐름 후드에 부분적으로 건조. 수 중 400 X 확대 (16 필드 계산) 또는 (4 필드 계산), X 200에서 appressoria 뿐만 아니라 coverslip (기본 conidia, 세균된 conidia 및 새로 형성된 된 이차 conidia)에 존재 하는 모든 conidia (총 conidia) 총 면적 3.808 m m 2. 전체 생물 검정 통계 분석에 대 한 복제. 물 기반 FE를 사용 하 여 분석 실험, 분석 데이터 Waller 외 에 설명 된 대로 201716, 일반적으로 평균 수/m m2 (총 conidia 또는 appressoria) 표시. 8. 클로 프롬 기반 꽃 추출 (ch-FE)17 을 사용 하 여 검정 참고: 그림 2를 참조 하십시오. 재료를 준비 하 고 세포 (7.1 조치) 위에 당 문화 요리. 또한, 내 연기 후드, 유리 피 펫 (1 mL 1 µ l 단위로) 뿐만 아니라 coverslips, 밴 Tieghem 셀 (VanT.)의 동일한 수 (8 m m OD, 6 m m ID) 린스 (95%로 두 번 다음 클로 프롬으로 두 번 EtOH), 따로. 층 류 두건 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 두 개의 동일한 볼륨 SDW의 (적어도 500 µ L 부분) 및 포자 현 탁 액의 1 볼륨을 추가 다음 따로 설정. 이것은 채널-FE 생물 검정에 대 한 수성 치료 혼합물 이다. 증기 두건에서는 VanT 놓습니다. 준비 된 플라스틱 셀 문화 접시 내 유리 coverslip에 셀입니다. 특 면 (유리 피 펫) 원하는 채널-FE의 33 µ L 반 티 셀의 가운데에 (는 VanT의 벽을 다치 지 마십시오. 셀; 제어 치료에 대 한 추가 처녀 클로 프롬), 건조를허용. 복제 (적어도 3)에 대 한 별도 셀 문화 요리를 반복 합니다. 채널-FE 건조가 일단는 VanT의 센터에 표준 피 펫으로 준비 된 수성 치료 혼합물의 99 µ L을 분배. 셀, 다음 닫기 모든 세포 문화 요리. 일단 수성 치료 혼합물 건조 채널-FE 치료 접촉은, 생물 검정 시작 했다, 0 h 후 접종. 일단 모든 치료 및 복제 적절 되었습니다, 모든 (닫히는) 세포 문화 요리 밀폐 플라스틱 용기 (30 x 13 x 7mm)로 놓고 어둠 속에서 25 ° C에서 품 어. 미리 결정 된 시간-포인트에는 VanT에 정착 액 (lactophenol 면-파란색)의 15 µ L를 추가 합니다. 셀 그리고 적절 한 곰 팡이 얼룩을 보장 하기 위하여 적어도 5 분 동안 앉아서 하자. 그 시간 후, 조심 스럽게 제거는 VanT. 셀 하 고 위의 (단계 7.5-7.6) coverslip 반전 및 데이터 수집 단계에 따라. 데이터 분석, Gager 201517, 일반적으로 표시 데이터 appressorium 형성, 즉 appressoria (3.808 m m2)를 관찰 하는 영역에서 계산을 총 conidia의 비율에서에서 설명한 방법을 따릅니다. 9. 크랜베리 기후학 기반 기사17 손 수집 크랜베리 꽃 (6 월; 100 g), 미 성숙한 과일 (두 번; 7 월과 8 월; 200 g), 수확에 크랜베리 과일 성숙 (10 월; 200 g), 적절 한 크기의 비닐 봉지에 배치와 4 ° C에서 수령 후 즉시 냉장 보관. (단계 2.1) 위에서 설명한 오염 예방 조치를 사용 합니다.참고: 각 시간에서 수집 된 추가 공장 설비 재료 것 하지만이 금액 분명 곰 팡이 감염 된 난소와 과일 (증상 및 질병의 표시를 보여주는) 추출 방지. 이전 추출, 어떤 악화, 손상, 질병 꽃 다음 곡선된 겸 자 (45 ° 족집게)으로 sepals, peduncles, corollas, 낙인, 작풍 및 stamens를 제거 하 고 난소를 제외한 모든 삭제만 건강 한 꽃을 사용 하 여. 일단 난소 수집 수행 1에서 클로 프롬 기반 추출 wt: 9 집 비율 (난소만을 사용 하 여 4.2-4.4, 단계에 자세히 설명). 다른 모든 기사, 완료 될 때까지 샘플을 저장 , 즉 검정 전도성까지. 일단 과일 수집, 클로 프롬 기반 추출 (4.2-4.4 사용 하 여 단계 수집된 과일 꽃 대신), 하지만 클로 프롬의 90 mL에 과일의 10 g를 추가 하 고 한 번 추출, 솔루션 (10 g: 9 mL wt 결과 9 mL를 증발을 허용합니다 : 집 솔루션). 7 월, 8 월, 그리고 10 월에 수집의 직후 과일 기사를 확인 합니다. 모든 기사는 수집 될 때까지 (4.4 단계) 위의 당으로 저장 합니다. 마지막 클로 프롬 기반 과일 추출 후 모든 클로 프롬 penology 기반 추출 물을 클로 프롬 기반 생물 검정에이 분석 결과 대 한 수집 대상이 고 따라서 분석 (8.1 8.6 단계).
Representative Results
여기에 제시 된 결과이 방법론을 사용 하 여 수행할 수 있는 많은 분석 실험의 몇 가지 예입니다. 그림 1 은 물 기반 FE 검정에 그림된 가이드 그리고 그림 2 는 클로 프롬 기반 FE 생물 검정에 의해 보충. 그림 3 에서는 무슨 C. fioriniae 의 미세한 평가 두 물 및 클로 프롬 기반 생물 검정 (비교 SDW 컨트롤)에서 24 시간에 따라 예상 될 수 있는 시각적 가이드. 그림 4 크랜베리 다양 한 ‘스티븐 스’ 채널-FE, 존재 C. fioriniae 는 24 시간 코스 연구 하 고이 연구의 결과 가져오기에 대 한 시각적 참조를 제공: FE 감염 구조를 형성 하는 데 필요한 시간을 감소 SDW에 비해. 그림 5 는 coverslip 검정 적갈색 꽃 빗 물 흐르는 빗 물 (CB “꽃” rw-FE)를 사용 하 여에서 수집 된 데이터의 예를 제공 합니다. 그림 6 다른 중요 한 결과 나타냅니다: 꽃 난소 채널-FE은 훨씬 더 보다 과일 채널-FE, 꽃의 수명 주기에서의 중요성을 나타내는 물질로 C. fioriniae. 추가 사진 및 동영상 추출 및 꽃 빗 물 수집 장치/배포, 시각화 및 액티브- 패시브- 추출 (영화 이외에 사용 하는 꽃의 중요 한 영상을 제공합니다 물 기반) 프로세스입니다. 그림 1 : 꽃 물-기반의 일반 개요 추출 (FE) 검정. 이 분석 결과 블루베리와 크랜베리 꽃 꽃 추출 물-기반에 대 한 이용 되었다: 액티브-꽃 추출 (액티브-FE), 수동-꽃 추출 (통과-FE)와 꽃 빗 물 흐르는 빗 물 (rw-FE). -FE 일반적으로 실험/변수 요소를 구성 하는 부분. 반대로-FE 부분 일정 하 게 유지 수 및 시간 포인트/시간 후 접종을 평가할 수 있다. 200 X 배율에서 4 필드 분석으로 설정이 했다. 약어: 살 균 이온된 수, SDW; A. 보기의 필드 당 지역 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 꽃의 클로 프롬 기반 일반 개요 추출 (ch-FE) 검정. 이 분석 결과 블루베리와 크랜베리 (꽃, 난소 및 과일)를 위해 이용 되었다. 이 분석 결과, 1 부분 포자 정지 (conidial 농도 채널-FE 증발 때문에 일관성 유지)에 2 개 부품 SDW 수성 치료 혼합물의 한 유형을 사용 되었다. 이 분석 결과 여러 채널-FE (다양 한 식물 표면에서 왁 스), 또는 여러 시간 포인트/시간 후 접종 단일 채널-FE를 사용 하 여 비교에 사용할 수 있습니다. 약어: 살 균 이온된 수, SDW; 반 Tieghem [유리] 셀, VanT입니다. 셀입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : Colletotrichum fioriniae 물 기반 FE와 채널-FE 존재의 시각적인 비교. 이 분석 결과 블루베리 ‘Bluecrop’에서 (활성-FE, 물 기반) (곰 팡이 분리: BB #10)와 크랜베리 ‘스티븐 스’ 클로 프롬 기반 (ch-FE) (곰 팡이 분리: CB PMAP182) 꽃 추출 SDW 컨트롤에 비교 했다. Conidia SDW (제어) (A) 활성의 존재를 비교할 때 보조 conidiation (반지)과 appressorium 형성 (화살촉)에 극적인 증가 관찰 했다-24 h 후 접종에 FE (B) . 그러나, 보조 conidiation이 아니었다으로 명백한 채널-FE (D);을 클로 프롬 검정 SDW 제어 (C)을 비교 했을 때 오히려, C. fioriniae 성장 appressorial 형성 쪽으로 이동. 표시 된 각 추출 유형, 물 기반에 대 한 일반적인 응답 이며 클로 프롬-기반으로, 호스트/꽃 종에 설명. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 시간-과정 연구 (24 시간) Colletotrichum fioriniae 채널-FE 존재. 이 분석 결과에서 SDW 제어 (A-D) 와 크랜베리 ‘스티븐 스’ 채널-FE (E-F) 시각적으로 검사 했다 0, 6, 12, 그리고 24 시간 후 접종 (여러 FE를 비교 하는 대신 가변 시간 점의 예). Appressorium 형성 (화살촉) 채널-FE에 6 h에서 시작 되 고 이후의 시간 포인트에 걸쳐 꾸준히 증가. 이 결과 피는 기간 동안 병원 체 생물학의 중요 한 요소를 회피 한다: 꽃 감염 구조를 형성 하는 데 필요한 시간을 단축. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 한 생물 검정에 rw-FE를 사용 하 여 수집 된 데이터를 그래픽으로 표시. 빗 물 크랜베리 꽃 (CB “꽃” rw-FE)의 실행 및 단일 일로 이벤트 플러스는 표준 활성, 적갈색 물 꽃 추출 물 (CB 활성에서 어떤 크랜베리 식물 조직 (“땅” rw-FE) 손도 안 했다 처녀 빗 물 -FE) (긍정적인 제어)와 SDW (부정적인 컨트롤) 물 기반 coverslip 검정을 받게 되었고 C. fioriniae 성장에 대 한 평가. CB “꽃” rw-FE는 표준 CB로 활성보조 conidiation 및 appressorium 형성의 동일한 수준을 했다-수집 장치 캡처 동안 발표 하는 꽃 자극에 효과적 이었다는 것을 나타내는 24 h 후 접종에서 FE는 일로-이벤트입니다. 총 conidia (입금) 기본, conidia 및 새로 형성된 된 이차 conidia 구성 됩니다. 문자 나타냅니다 p < 0.05 피셔의 적어도 상당한 차이 따라 상당한 차이가 테스트 (LSD); 대문자, 총 conidia; 소문자, appressoria입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 : 크랜베리 기후학 기반 채널-FE 검정, 육안 검사. 종종 곰 팡이 썩는 과일에 대 한 질병 관리 꽃 시간 균 응용 프로그램을 포함 한다. 여기, 크랜베리 클로 프롬 기반 추출 물 (ch-FE) 적갈색 (‘스티븐 스’)의 여러 성장 단계에서 24 시간 후 접종에서 C. fioriniae 에 표면 왁 스의 효과 대 한 시각적으로 평가 했다. 6 (A), 7 월과 8 월에 수집 하는 미 성숙한 과일에에서 난소 수집 (B, C), 수확된 과일 10 (D), 월에서 수집과 SDW 컨트롤 (E) appressorial 형성 (화살촉)에 대 한 검사를 했다. 난소 채널-FE appressorial 형성,이 식물 기후학 (꽃) C. fioriniae의라이프 사이클에 매우 중요 하다의 가장 큰 크기를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 1: 블루베리 꽃이 핌. 블루베리 꽃 만개 (뉴저지, 미국에서에서 4-5 월) 동안 기사 (‘Bluecrop’ 참조)에 대 한 수집 했다. 인접 한 꽃에서 corollas/난소의 중복 및 보충 그림 2 (적갈색 수직)에 비해 꽃이 핌의 전반적인 아키텍처를 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 2: 크랜베리 직. 크랜베리 꽃 만개 (뉴저지, 미국에서에서 6 월-7 월) 동안 기사 (‘스티븐 스’ 표시)에 대 한 수집 했다. Note 크랜베리 단일 화 서 (직 립), 그리고는 갈고리에 다양 한 꽃 단계, 코 롤 라의 형태를 유지 하는 물방울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 3: 블루베리 빗 물 배포 (꽃). 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치, 클러스터 inflorescences의 바로 아래 배치 완료. 플라스틱 코팅 와이어를 수직으로 하는 장치 사용 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 4: 블루베리 빗 물 배포 (줄기). 완성 된 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치, 줄기는 꽃이 핌과 부시 대통령의 아래 절반 방법 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 5: 블루베리 빗 물 배포 (크라운). 블루베리 꽃 빗 물 수집 장치, (크라운) 부시 대통령의 기지에 배치 완료. 참고 플라스틱 코팅된 전선 필요 하지 않은 경우 제거할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 6: 블루베리 빗 물 배포 (접지). 처녀 빗 물 수집 장치, 블루베리 나무에 인접 한 배치 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 7: 크랜베리 빗 물 배포 (클로즈업). 깔끔하게 교차 와이어 타이 아래 자리 잡고 두 uprights 크랜베리 꽃 빗 물 수집 장치, 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 그림 8: 크랜베리 빗 물 배포. 다중 크랜베리 꽃 빗 물 장치 늪지에 배포 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 보충 영화 1: 활성, 물 기반 꽃 추출 물 (액티브-FE). 추가 비디오 지원 단계 2.3-2.5.1. 블루베리 ‘Bluecrop’ 꽃 사용 되었다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.) 보충 영화 2: 수동, 꽃 추출 물 (통과-FE). 추가 비디오 지원 다음 단계 3.3-3.4. 블루베리 ‘Bluecrop’ 꽃 사용 되었다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.) 보충 영화 3: 크랜베리 꽃 빗 물 수집 장치 배포. 추가 비디오 지원 다음 6.4 단계. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
Discussion
C. fioriniae 응답 꽃 추출 물 (FEs)을 감지 하는 생물 검정 블루베리와 크랜베리 열매에 대 한 부패 pathosystems 개발 했지만 다른 원 예 작물에 쉽게 적용할 수 있습니다. 위의 상세한 프로토콜 포함 하 여, 많은 중요 한 데이터 집합을 얻는 귀중 한 되었지만에 국한 되지 않음: 시간 코스 정보 다양 한 FEs의 존재 곰 팡이 성장 단계에 관련 된 수많은 병원 체의 여러 격리에 FE 효과 추출 기법 비교, C. fioriniae 성장과 분화, 개별 꽃 기관의 평가에 개별 화학 물질의 추출, C. fioriniae FE, 효과 존재 동안에 온도 효과 기후학 종속 왁 스 기사와 꽃 빗 물 효과. 이러한 기술을 사용 하 여 생성 된 데이터 제공 C. fioriniae 생활의 많은 명확 하 게 이해 단계 및 꽃 기간은 병원 체 썩 어 많은 열매의 관리에 중요 한 이유를 부분적으로 보통 또한 있다.
처음에, 모든 꽃은 활성동일 하 게 처리 된-FE, 하지만 추출 과정 전체 꽃을 사용 하 여 쪽으로 이동 했습니다. 꽃 해 부 시간이 소요 되었고 결과 FEs의 bioactivity에 매우 작은 영향을 했다. 그러나, 개별 꽃 기관 수 있고 되어 평가 사용 하 여이 프로토콜, 하지만 신중 해야 합니다로 이동 완전히 꽃 조직 (보충 영화 1, 2.3 단계에 대 한 자세한 주의 사항), macerate이 될 수 있습니다 릴리스 미세한 평가 왜곡 수 있는 철에 곰 팡이-독성/정적 화합물. 등 패스-침략 적 기사 덜 FE (보충 영화 2) 및 rw-FE는 수집의 그들의 용이성으로 인해 더 유리한 지금. 또한, 이러한 추출 기법 생물학적으로 활성 꽃 화학 신호를 얻으려고만 진공 여과 필요 합니다.
모든 기사에 이용 하는 꽃은 일반적으로 0-3 냉장 일전 추출 준비. 이 프로토콜의 도전 FE 회전율 (추출의 저장 장치를 통해 필드 컬렉션)의 시간 관리 이다. 이 여러 소스와 날짜에서 수많은 샘플에 의해 악화 되었다. 냉동된 꽃 해 동된 꽃 표시 악화 및 변색, 실제 정도로 평가 하지 않았습니다. 그러나, 일단 물 기반 FEs 준비 된, 냉동을 반복 하 고 녹고에 아무런 영향을 보이고 있다 그래서 만큼 철 FE의 bioactivity는 신속 하 게 검정 준비 (가능한 3 년 된 FE) 후 refrozen.
클로 프롬 기반 추출 유리 coverslips에 채널-FE 증발을 통해 2 차원 평면에서 3 차원 꽃/과일 표면 왁 스 병원 체 응답의 조사 수 있습니다. 그러나, 채널-FE에서 입금 하는 왁 스의 실제 결정 구조는 그들이 수집 표면에 동일 가능성이 크다. 만약 곰 팡이 응답 특정 왁 스 구조에서 vivo에서 조사의 주요 초점 의미, 보완 기술 구현 되어야 합니다. 클로 프롬 기반 추출 물에 기초를 둔 기사 보다 더 많은 스토리지 유지 보수가 필요합니다. 어둠 속에서 ch-FE 추출 물 유지, 이외 줄지어 PTFE 세포 배양 모자와 증발 누수에 대 한 정기적으로 검사할 필요가 포장 씰링 parafilm 튜브를 필요에 따라 대체.
꽃 빗 물 유출 모니터링의 개념 특정 질병 모니터링 도구 발전의 아이디어에 뿌리입니다. 빗 물 수집 장치 컬렉션 장치 캡처 빗 물 꽃의 실행으로 다른 많은 식물 구조에 적응 될 수 있다. 이 이렇게 꽃 자극의 어떤 주어진된 시간에 필드에 존재 하는 및 시즌 내내 감시 될 수 있다 여부에 정보를 제공 합니다. 또는, 수집 장치는 얼마나 꽃 단서는 세탁 주어진 동안 일로 이벤트를 확인 하려면 여러 캐노피 위치에 배포할 수 있습니다. 미래에 실험, rw-FE 쓰게 됩니다 균 응용 프로그램을 시작 해야 하 고 때 그들은 안전 하 게 끝낼 수 있습니다. 또한, 기후학 종속 왁 스 기사 (프로토콜 섹션 9)를 모니터링 하 여 병원 체 생물학 꽃 기간의 중요성이 되고있다 훨씬 더 분명. 그 부분 또한 일시적으로 분리 되어 있는 호스트 표면 왁 스의 측면-의해-측면 비교를 위해 사용할 수 있는 메서드를 제공 하, 이러한 생물 검정의 유연성을 보여 주기 위해 포함 되었다. 꽃 추출 기술과 생물 검정을 사용 하 여 생성 하는 데이터 유형 지표를의 병원 체, 병원 체 생물학, 및 미래 제어 전략을 위한 목표에 중요 한 특정 화학 클래스를 나타냅니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 윌리엄 S. 하인즈, 미스터 부여 크랜베리 연구 기금 뉴저지 블루베리와 크랜베리 연구 협의회, Inc. 지원에 대 한 감사. 우리는 또한 제니퍼 Vaiciunas (지도 꽃 준비), 크리스틴 Constantelos (곰 팡이 문화 및 꽃 준비), 데이비드 존스 (꽃 준비 및 기사), 랭 글 리 Oudemans (꽃 준비, 촬영/사진), 제시 감사 합니다. 린치 (꽃 준비), 록 산 Tumnalis (일반 지원), 그리고 수많은 학생/여름 수련.
Materials
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | – | – | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Curved forceps (45˚) | Fisher Scientific | 10-270 | Equipment, flower processing and coverslip inversion |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | – | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | – | – | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Freezer (set to -20˚ C) | – | – | Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE |
| Fume hood | Hamilton | – | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | – | – | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | – | – | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Incubator (set to 25˚ C, dark) | Percival | 50036 | Equipment, bioassay conductance |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | – | – | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | – | – | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | – | – | Equipment, FE preparation |
| Refrigerator (set to 4˚ C) | – | – | Equipment, storage of ch-FE |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | – | – | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | – | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | – | – | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | – | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | – | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
Referências
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Citar este artigo
Waller, T. J., Gager, J. D., Oudemans, P. V. Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts. J. Vis. Exp. (146), e58880, doi:10.3791/58880 (2019).