COLLETOTRICHUM fioriniae Développement dans l’eau et des extraits floraux axée sur le chloroforme aux bleuets et aux canneberges

1. fongiques isolats et Suspensions de spores Isolent Colletotrichum fioriniae un hôte infecté naturellement19. Ensuite, rangez les cultures propres sur les pentes de gélose (CMA) de semoule de maïs. Placer le bouchon de culture (à partir de la pente de CMA) sur une culture cellulaire en plastique standard plat (9 cm de diamètre) contenant que soit clarifié V8 jus gélose (cV8A) (modifié d’après 1955 Miller), ou non-précisé V8 jus gélose (V8A)20. Quand les colonies commencent à sporuler, strier les conidies (masses conidiennes orange) sur un autre cV8A ou V8A contenant plat culture cellulaire (avec une boucle stérile standard) pour produire une culture à haute densité de sporulation.Remarque : Aucune mesure de protocole avec des champignons doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire pour réduire les risques de contamination de cultures fongiques et/ou biologiques. Après que 7 jours de croissance, à l’aide d’une anse stérile standard recueillir une petite quantité de conidies de la culture à haute densité (en appuyant légèrement sur la boucle à la masse de conidies) et incorporer cela dans un tube à centrifuger 15 mL contenant 10 mL d’eau désionisée stérile (SDW). Vortex cet exemple pour 10 s, puis à l’aide d’une pipette standard plonge monter et descendre plusieurs fois au mélange encore l’échantillon. Ensuite, déposez une goutte de l’échantillon de mixés sur le hémocytomètre et estimer les concentrations de spores. Nombre 5-10 champs sur l’hémocytomètre, obtenir la moyenne et multiplier la moyenne par le facteur de dilution appropriée (c.-à-d. 10 000), obtenant ainsi la concentration de conidies / mL SDW. Puis à l’aide d’un volume (V) / équation de la concentration (C) (V1● [C1] = V2● [C2]) ajuster (avec SDW) à 1,0 X 10 conidies de5 millilitres de SDW avec un volume final de 5 mL. Ceci est dénommé la suspension de spores et ne s’effectue qu’immédiatement avant de les utiliser dans un test biologique. 2. actif, à base d’eau florale extraits (active -FE)15,16 Remarque : Voir la Figure 1, la Figure 2, supplémentaire Figure 3et film supplémentaire 1. Soigneusement main-collect blueberry (avril-mai) et canneberges fleurs (juin-juillet) au cours de leurs fleurs pointe respectives dans le domaine (la Figure 1). Porter et changer de gants en nitrile entre sites d’échantillonnage (emplacements des cultivars et variétés/physiques) pour empêcher la contamination de l’huile de la peau humaine ainsi que la contamination croisée entre variétés florales. Placez les fleurs de bleuet ou canneberge (d’une source unique) dans des sacs en plastique (remplir un sac de 100 x 150 mm) et réfrigérer immédiatement à 4 ° C une fois que les fleurs sont recueillies.Remarque : L’extraction active – est modifiée par Leandro et al. (2003) 16. Avant l’extraction, enlever les fleurs détériorés, endommagés, malades, puis à l’aide de fleurs sains enlever les ovaires, les sépales et les pédoncules avec une pince courbe (45 ° pincettes) et jeter. Utilisez uniquement les organes restants (corolla, stigmatisation, style et étamine) pour active – extractions. Couper la toile de coton (150 x 150 mm) et placer dans un entonnoir de 7 x 7 mm, placer dans un tube à centrifuger propre 50 mL et mis de côté. Mélanger 1 partie transformés fleurs à 9 parties SDW (1 wt : 9 ratio de vol) dans un mortier. Doucement broyer avec un pilon pendant 30 s (attention pas complètement pulvériser les échantillons). Souche résultante pâtes préparées étamine/entonnoir et s’accumuler dans le tube à centrifuger (50 mL). Nettoyer ou utiliser le nouveau mortier/pilon entre chaque extraction avec 95 % EtOH et l’eau courante tiède. Préparer un appareil de filtration sous vide : rassembler l’entonnoir Buchner, fiole d’Erlenmeyer de filtre à vide (jusqu’à 1 000 mL de capacité), papier filtre de 55 mm cercle et tuyau/source de dépression. Ajouter filtre papier à un entonnoir de Buchner taille approprié et placer au sommet de la fiole, puis connecter l’appareil à une eau / d’aspiration source via le tuyau d’aspiration et mis de côté. Clarifier les extraits floraux de bleuets par centrifugation pendant 10 min à 8 055 x g. Décanter le surnageant dans appareil filtre à vide prêt, allumez la source de vide, filtrer le liquide surnageant, puis versez le contenu de la fiole dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL). Nettoyer tous les composants d’appareils entre chaque filtration 95 % EtOH et l’eau courante tiède. Filtre supplémentaire grâce à une seringue adaptée avec un 0,22 µm taille des pores, acétate de stérilisation, filtre dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL). Pour les extraits de canneberge florales, l’aspirateur seulement filtrer sur papier filtre et versez le contenu de la fiole dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL). Préparation en résultant est dénommée active- extrait floral (active -FE). Conserver tous les extraits floraux aqueux (active-, passif-, collections d’eau de pluie) à-20 ° C en aliquotes de 5 à 50 mL jusqu’à l’utilisation expérimentale. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons (au moins 3 extractions par type d’échantillon) pour donner la réplique. 3. passif , à base d’eau florale extraits ( pass -FE) 16 Remarque : Voir film supplémentaire 2. La main de fleurs de bleuets entiers frais virés (50 g) comme indiqué ci-dessus et réfrigérer après avoir recueilli. Avant l’extraction, enlever les fleurs détériorés, endommagés, malades et supprimer uniquement les pédoncules de fleur intact. Réfrigérer les échantillons préparés jusqu’à ce que le passif – système d’extraction, décrit ci-dessous, est en place. Rincer tous les éléments avant toute utilisation avec 95 % d’éthanol (EtOH) et l’eau chaude pour éviter la contamination (feuille de maille en plastique, deux paniers de maille en plastique, verre moule à pain et flacon de brume de pompe). Également préparer un tube à centrifuger étamine/entonnoir/50 mL 4 couches pour chaque extraction décrites ci-dessus (à l’étape 2.2) et mettre de côté. Préparer le tamis : Placez une feuille de plastique maille (alias claire bar tapis) dans une maille en plastique, panier (114 x 102 mm). Placez un panier de deuxième, identiques, maille envers (inversées) dans un verre-moule à pain (127 x 229 mm) (pour éviter les fleurs assis dans SDW) et placez le maillage feuille contenant panier au sommet. Ajouter 50 g de fleurs disposés dans la passoire.NOTE : Vous pouvez également paniers petit tube à essai [nettoyage] peuvent être utilisés à la place les paniers utilisés à l’origine de la maille en plastique (maille vieux, vert, fraise pinte paniers sont souvent difficiles à la source). Uniformément fleurs de brume avec 250 mL à l’aide d’une pompe à flacon de brume et capturent des eaux de ruissellement dans le moule à pain verre. Puis filtrer le filtrat dans l’étamine/entonnoir préparé dans un tube à centrifuger propre. Préparation en résultant est dénommée passif- extrait floral (pass -FE) ; stocker comme indiqué ci-dessus (étape 2.6). Nettoyer tous les composants entre chaque extraction avec 95 % EtOH et l’eau courante tiède. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons pour fournir la réplique (au moins 3 par type d’échantillon). 4. chloroforme-basé des extraits floraux (ch-FE) 17 Recueillent les fleurs de bleuet et la canneberge comme indiqué ci-dessus (étape 2.1) et préparer les fleurs pour l’extraction (étape 2.2, sans préparation d’étamine/entonnoir). Gardez les fleurs préparés au réfrigérateur jusqu’à ce que, avant utilisation. Tout travail effectué par le chloroforme doit être effectuée sous une hotte pour des raisons de sécurité. Cela comprend la préparation de matériaux / verrerie, procédés d’extraction et dosage biologique la conductance (étapes à l’aide de ch-FE). Nettoyer tous les composants dont 95 % EtOH deux fois, puis deux fois avec du chloroforme pour prévenir la contamination pour chaque extraction : filetage de tubes de culture de verre, 2 béchers en verre, en acier inoxydable petit écran et un cylindre supérieure [verre]. Mettre de côté à sécher à l’envers. Rincer les casquettes de polytétrafluoroéthylène (PTFE) doublé deux fois avec 95 % EtOH seulement (chloroforme peut endommager les matériaux extérieurs de la PAC) et mettre de côté à sécher. Mélanger 1 partie transformés fleurs à 9 parties chloroforme (1 wt : 9 ratio de vol) dans un bécher (fleurs puis chloroforme), doucement tourbillon pour 30 s et la souche à travers un tamis en acier inoxydable dans le deuxième bol. Versez ch-FE du deuxième bécher dans le tube à culture de verre (10-15 mL) et fixez le bouchon PTFE. Envelopper le bouchon avec du parafilm pour éviter l’évaporation. Cette préparation est l’extrait floral axée sur le chloroforme (ch-FE). Stocker l’échantillon dans l’obscurité (pour réduire la dégradation légère) à 4 ° C jusqu’à l’utilisation expérimentale. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons pour fournir la réplique (au moins 3 par type d’échantillon). 5. collecte des eaux pluviales de fleurs de bleuet (BB rw-FE)16 Remarque : Le dispositif de prélèvement de pluie florale bleuet se compose d’une coupe de pulvérisation air pistolet peinture jetable avec adaptateur de connexion (coupe : filetage femelle, adaptateur : filetage mâle), tubes de centrifugeuse 50 mL (polypropylène), parafilm et fils enrobés en plastique ( fil téléphonique standard, contenu de brin de fil interne). Sélectionnez plusieurs emplacements au sein d’un buisson de myrtilles pour capturer exécuter hors de fleurs avant de créer des dispositifs de prélèvement de l’eau de pluie. Il s’agit directement sous les inflorescences (fleurs) à la base même de la brousse (couronne). Record diamètre des tiges (allant de 1 à 5 cm) à certains endroits, car cela déterminera la taille des trous utilisés pour la fixation de l’appareil, décrite ci-dessous. Pour chaque emplacement sélectionné créer un dispositif de collecte. Tout d’abord percer un trou au fond d’une tasse de pulvérisation (où les courbes de la coupe vers l’ouverture filetée) le diamètre de tige correspondant, avec un étape-peu attaché à une presse de foret. Ensuite, couper une ligne droite du haut de thehole jusqu’à l’embouchure de la coupe de la pulvérisation. Percez 4 trous équidistants (assez grands pour fil le fil enduit en plastique), à l’embouchure de la coupe de pulvérisation et fixer une extrémité des câbles en plastique enduits laissant une extrémité libre. Percer un trou assez grand pour visser l’adaptateur de tasse de pulvérisateur de peinture dans un couvercle de cap de centrifuger de 50 mL. Etouper adaptateur filetage avec parafilm pour éviter des fuites. Fixez-la au cap de la centrifugeuse et la partie filetée de la Coupe du pulvérisateur. Fixer le tube à centrifuger accouplées 50 mL. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 pour créer plusieurs périphériques selon les endroits choisis, un minimum de dispositifs de prélèvement 4 par site d’échantillonnage. Déployer des dispositifs à des endroits choisis par flexion tasses pulvérisateur pour les poser sur les tiges. Orientez la côté coupé de la coupe de pulvérisation vers le haut en utilisant les fils gainés attachés aux autres tiges (pour assurer l’eau passant sur les fleurs est capturé). Apposer parafilm ouvertures qui pourraient couler l’eau de pluie. (Supplemental Figure 3, supplémentaire Figure 4, supplémentaire Figure 5et supplémentaire Figure 6). Tubes de prélèvement d’étiquette avec déploiement date / heure. Après un pluie-événement, enlever et remplacer la partie inférieure (tube) du tube à centrifuger (étiquette de date / heure de collection). Apportez des collections de ruissellement (dénommées extrait floral de bleuet l’eau de pluie (BB rw-FE)) à l’intérieur et aspirateur filtre (filtration décrite dans les étapes 2,4-2,5). Magasin comme ci-dessus (étape 2.6), jusqu’à utilisée dans un bioessai à base d’eau. 6. collecte des eaux pluviales de Cranberry fleurs (CB rw-FE) Le dispositif de collection florale eau de pluie dans la canneberge se compose d’un entonnoir en polypropylène 7 X 7 cm, tubes de centrifugeuse 50 mL (polypropylène), parafilm, et 4 standard, en plastique enduit attaches (par appareil). Tout d’abord, chaleur perforer 8 trous équidistants (diamètre des attaches) autour de la bouche de l’entonnoir à l’aide d’une sonde métallique. Insérer les attaches dans les 4 trous. Fixez l’autre extrémité à endroit opposé des que trous, formant un modèle de croisement soignée. Envelopper l’entonnoir vers le bas-tige avec du parafilm et mettre de côté. Percer un trou assez grand pour insérer la tige vers le bas entonnoir dans un bouchon de centrifuger de 50 mL avec un étape bits. Insérer entonnoir préparé dans le capuchon de la centrifugeuse. Répétez les étapes 6.2-6.3 pour créer plusieurs périphériques, moins collection 4 unités par site d’échantillonnage. Déployer périphériques marqués (date/heure) dans des tourbières canneberges sélectionnés. Soigneusement rentrez deux inflorescences fleur roulement (appelées pousses) sous les attaches en plastique croisées. Ensuite verticalement orienter l’appareil en perçant le tube à centrifuger dans la canopée de canneberge (Supplemental Figures 7 et 8, Supplemental Movie 3). Après la pluie ou les frais généraux d’irrigation, enlever et remplacer la partie inférieure (tube) du tube à centrifuger (étiquette date / temps de collection). Amener les eaux de ruissellement (dénommée extrait floral de canneberge eau de pluie (CB rw-FE)) à l’intérieur et aspirateur filtre (filtration décrite dans les étapes 2,4-2,5). Magasin comme ci-dessus (étape 2.6), jusqu’à utilisée dans un bioessai à base d’eau. 7. essai biologique à l’aide d’extraits d’eau basée Floral15,16 (active-FE, passer-FE, rw-FE) Remarque : Voir la Figure 1. Cet essai biologique est préparé dans une hotte à flux laminaire. Préparer du matériel : lamelles de verre triple rinçage avec 95 % EtOH et l’air sec, puis mettre de côté. Couper les disques de serviette de papier du diamètre interne d’un pétri de cellule en plastique standard (9 cm). Mettre 2 couches de disques de papier dans les récipients de culture et tremper avec 2 mL SDW. Préparer au moins 5 mL de 1,0 X 10 conidies5 millilitres de SDW suspension de spores (c. fioriniae) comme indiqué ci-dessus (étape 1.2 à 1.4), mis de côté. Ensuite, mélanger des quantités égales de SDW et extrait floral aqueux dans 2 mL tubes de microcentrifuge. Puis, ajouter un volume égal de la suspension de spores sur les tubes de microcentrifuge préparé 2 mL (SDW plus FE) ; la préparation en résultant est dénommée un mélange aqueux de traitement. Pour le contrôle, omettre la partie FE et remplacez par SDW, pour assurer la cohérence des concentrations de conidies.Remarque : taille de la portion dépend de nombre de réplicats et points dans le temps. En règle générale, les parties ne dépassent pas 500 µL. Une fois que les conidies et FE sont combinées l’essai biologique a commencé, après l’inoculation de 0 h. Placez les lamelles de verre préalablement nettoyé sur le dessus de l’essuie-tout imbibé dans le plat de culture cellulaire. Placez une goutte de 40 µL du mélange de traitement aqueux sur le centre d’un lamelle couvre-objet. Répéter pour les traitements souhaités, y compris le contrôle, fermez la boîte de Petri de cellule. Répéter dans les récipients de culture de cellule séparée des réplications (au moins 3) et de points de temps (chaque plat est pour 1 point dans le temps). Une fois que tous les traitements et les réplicats ont été distribués, tous les récipients de culture de cellule répliqué dans un récipient hermétique en plastique (30 x 13 x 7 mm) et incuber à 25° C dans l’obscurité. À des moments prédéterminés, ajouter 10 µL de fixatif comme lactophénol coton-bleu (cristaux de 20,0 g de phénol, 20,0 mL 2,5 % l’acide lactique, glycérol 40,0 mL, coton de 0,05 g bleu) dans les gouttelettes, arrêtant la croissance et semi-préserver la monture. Attendre 2 h pour recueillir le point de temps 0 h comme cela permet l’adhésion conidiale à la surface du verre, mais n’est pas assez long pour la germination des conidies. Pour tous les autres points dans le temps, ajouter le fixateur au moment correspondant. Après avoir ajouté un fixateur, soigneusement inverser les lamelles, plaçant côté goutte vers le bas sur une lame de microscope de verre pour faciliter l’examen microscopique (1 lamelle par lame). Lorsque toutes les lamelles sont sur les lames de verre, les laisser s’installer et partiellement secs sous la hotte à flux pendant 20 min. Compter que toutes les conidies (totales conidies) présentent sur la lamelle couvre-objet (conidies primaires, germination des conidies et nouvellement formé de conidies secondaires) ainsi que de l’appressorium soit 400 X grossissement (compter 16 champs) ou 200 X (en comptant 4 champs), totalisant une superficie de 3,808 mm 2. reproduire tout essai biologique pour l’analyse statistique. Pour les tests à l’aide de FE à base d’eau, analyser les données comme décrit dans Waller et al. 201716, généralement affiche aussi dire comte/mm2 (totales conidies ou appressoria). 8. bioassay aide axée sur le chloroforme Floral extraits (ch-FE)17 Remarque : Voir la Figure 2. Préparer les matériaux et cellules pétri comme indiqué ci-dessus (étapes 7.1). En outre, rincer un nombre égal de Van Tieghem (VanT. cellules) (8 mm OD, 6 mm ID) à lamelles couvre-objet, mais aussi une pipette de verre (1 mL avec des incréments de 1 µl) au sein d’une hotte aspirante, (deux fois avec 95 % EtOH puis deux fois avec le chloroforme) et mettre de côté. Sous hotte à flux laminaire, à l’aide d’un tube de microcentrifuge de 2 mL ajouter deux volumes égaux (au moins 500 portions de µL) de SDW et 1 volume de suspension de spores, puis mettre de côté. C’est le mélange aqueux de traitement pour les essais biologiques ch-FE. Sous une hotte, placer un VanT. cellule sur une lamelle de verre dans le plat de culture cellulaire en plastique disposés. Distribuer (avec pipette en verre) 33 µL de désiré ch-FE dans le centre de la cellule T. Van (ne pas toucher les parois de la VanT. Cellule ; pour le traitement de la commande, ajouter chloroforme vierge) et laisser pour sécher. Répéter dans les récipients de culture de cellules distinctes pour des réplications (au moins 3). Une fois que les ch-FE a séché, distribuer 99 µL du mélange préparé traitement aqueux avec une pipette standard dans le centre de la VanT. cellule, puis fermer tout pétri de cellules. Une fois le mélange aqueux traitement a entrer en contact avec les traitements secs ch-FE, l’essai biologique a commencé, après l’inoculation de 0 h. Une fois que tous les traitements et les réplicats ont été distribués, tous les récipients de culture cellulaire (fermée) dans un récipient hermétique en plastique (30 x 13 x 7 mm) et incuber à 25° C dans l’obscurité. À des moments prédéterminés, ajouter 15 µL de fixatif (coton lactophénol bleu) à le VanT. cellule et laisser reposer pendant au moins 5 min assurer la coloration fongique adéquate. Passé ce délai, retirer soigneusement le VanT. cellulaire et suivez lamelle inversion et données acquisition étapes ci-dessus (étapes 7,5 à 7,6). Pour l’analyse des données, suivez les méthodes décrites dans Gager 201517, généralement affichage des données de formation de l’appressorium, qui est le rapport des conidies totales d’appressoria comptés dans la zone de relevé (3,808 mm2). 9. canneberge Extractions axée sur la phénologie17 Main recueillent les fleurs canneberges (en juin ; 100 g), immatures de fruits (deux fois ; Juillet et août ; 200 g) et d’âge mûr canneberge fruit à la récolte (octobre ; 200 g), les placer dans des sacs en plastique tailles appropriée et garder au froid à 4 ° C immédiatement après le prélèvement. Utilisez les contamination des précautions décrites ci-dessus (étape 2.1).Remarque : Il y aura des végétaux supplémentaires prélevé à chaque fois, mais ces montants prémunir contre l’extraction des ovaires infectés évidemment fongiques et fruits (présentant les symptômes et les signes de la maladie). Avant l’extraction, enlever les fleurs détériorés, endommagés, malades, puis à l’aide de fleurs seulement sains, enlever les sépales, pédoncules, corolles, stigmates, styles et des étamines avec une pince courbée (pincettes de 45 °) et jeter tous, mais les ovaires. Une fois que les ovaires sont collectées, effectuer l’extraction axée sur le chloroforme à une 1 wt : 9 ratio de vol (détaillée en étapes 4.2-4.4, en utilisant seulement les ovaires). Conserver les échantillons jusqu’à ce que tous les autres extractions sont complètes, c’est-à-dire jusqu’à la conductance bioassay. Une fois que les fruits sont recueillis, réaliser une extraction axée sur le chloroforme (étapes 4.2-4.4, à l’aide de fruits récoltés au lieu de fleurs), mais ajoutent 10 g de fruit à 90 mL de chloroforme et une fois extrait, laissez agir la solution s’évapore dans 9 mL (conduisant à un poids de 9 mL 10 g : : solution de vol). Faire les extractions de fruits immédiatement après le rassemblement en juillet, août et octobre. Stocker comme indiqué ci-dessus (étape 4.4) jusqu’à ce que toutes les extractions sont collectées. Après la dernière extraction de fruit axée sur le chloroforme, sous réserve de tous les extraits de chloroforme axée sur la pénologie recueillies pour ce dosage à l’essai biologique d’axée sur le chloroforme et analyser en conséquence (étapes 8.1-8,6).