基于多色流式细胞仪的 t 细胞线粒体和溶酶体的定量

t 细胞的激活和增殖是成功免疫反应的关键步骤。最近的进展表明, 细胞代谢与 t 细胞的发育和功能密切相关。例如, 天真的 t 细胞在很大程度上依赖氧化磷酸化 (oxphos) 来满足继发性淋巴器官循环过程中的能量需求。激活后, 天真的 t 细胞会进行剧烈的代谢重新编程, 包括诱导好氧糖酵解, 以增加 atp 的产生, 并满足细胞分化和增殖过程中的巨大代谢需求。未能通过代谢的细胞死于细胞凋亡^1,2。在代谢重新编程过程中, 线粒体发挥着重要作用, 因为它们是主要负责产生 atp 的细胞器, 为细胞提供能量, 而细胞线粒体含量在代谢开关中波动在整个 t 细胞的发育和激活^过程中3。然而, 多余或受损的线粒体的积累会产生多余的 ros, 损害脂质、蛋白质和 dna, 并最终导致细胞死亡

代谢改变产生的过度或受损的线粒体被一种特殊形式的自体吞噬⁵(称为有丝分裂) 去除。线粒体被自体染色体包裹, 然后与溶酶体融合降解。线粒体和溶酶体之间的这些密切联系引起了人们的极大兴趣。例如, 氧化应激刺激线粒体形成线粒体衍生囊泡 (mdv), 其靶向溶酶体, 以便在磷酸酶和紧张素同源体 (pten) 诱导的假定激酶 1 (pink1) 和副蛋白 (e3 泛素聚类酶) 中降解依赖方式⁸。研究还发现, 有丝分裂是必不可少的甜菜到白色的脂肪细胞过渡^9,10。更重要的是, 溶酶体不仅是一个降解室, 也是细胞信号的调节剂。酶缺乏导致的基质积累过多, 导致溶酶体功能障碍, 破坏溶酶体膜通透性, 并影响 ca^{2 +}稳态¹¹。溶酶体酸脂肪酶 (lal)¹²或溶酶体代谢物转运蛋白敲除小鼠模型¹³的 t 细胞功能缺陷进一步显示溶酶体在维持 t 细胞稳态中的重要性。线粒体和溶酶体都是细胞代谢调节不可分割的部分。因此, 细胞线粒体含量的测定已成为评价 t 细胞代谢和功能状态的重要指标。

常用于量化细胞线粒体或溶酶体的内容包括免疫印迹、电子显微镜、免疫荧光 (if) 染色和线粒体 dna 拷贝数 14, 15 的 pcr 分析^{, 16}. 虽然免疫印迹可以定量地比较不同样本的蛋白质水平, 电子或 if 显微镜可以直观地显示这些细胞器¹⁷的形态特征, 但这些检测存在一定的技术缺陷。例如, 获取足够数量的具有高放大倍率和分辨率的细胞图像, 或比较几十个样本中蛋白质的表达水平, 使这些检测被认为是低吞吐量的方法, 是非常耗时的。此外, 这些检测只能应用于同质细胞群, 如细胞系, 而不能应用于由混合群体组成的组织样本。

同样很难将这些检测方法应用于罕见的人群, 因为对这些人群来说, 从 10 6 到 10^{8 的}最低细胞数量的要求是不可能满足的。最后, 细胞通常在过程中被裂解或固定, 使其与提取进一步信息的其他方法不兼容。与传统方法相比, 基于荧光的流式细胞仪具有相对较高的吞吐量–可以同时分析和收集混合细胞群样本中所有细胞的信息。此外, 可以检测同一细胞上的10个以上的参数, 并根据所需的表型对细胞进行排序, 以便进一步检测。反应荧光探针已被用来标记溶酶体和线粒体在活细胞中, 可以通过流式细胞仪检测 18^,19。这些特定于细胞的探针具有细胞渗透性, 具有物理化学特性, 使它们能够集中在特定的亚细胞位置或细胞器。方便地, 这些探头有各种荧光格式, 从而使其能够应用于多色分析。

该协议详细介绍了如何将表面标记染色与溶酶蛋白或线粒体特异性染料结合起来, 以标记活细胞中的溶酶体或线粒体。这对于从主要组织和器官中产生的样本尤其有用, 这些组织和器官通常由异质细胞群组成。研究人员可以通过其表面标记表达来识别感兴趣的细胞群, 并通过这些细胞中的有机细胞特异性染料专门测量溶酶体或线粒体含量。在这里, 我们演示流式细胞仪分析的详细过程, 评估溶酶体或线粒体质量的主要脾 t 细胞亚群。