cd8⁺ t 细胞诱导体外肿瘤细胞凋亡的实时检测--研究肿瘤浸润髓内细胞的免疫抑制作用

所有涉及老鼠的程序都是根据联合王国内政部的许可 (p526c60b3) 进行的。有关商业试剂和设备的信息列于材料表中。 1. 在细胞核中表达红色荧光蛋白的靶细胞的制备 从适当的来源获取目标小鼠癌细胞系。注: 在本协议中, 使用了 e0771 小鼠乳腺肿瘤细胞 (e0771-g)13的高度转移衍生物。父母 e0771 细胞来源于 c57bl6 小鼠14。 用 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) 解冻并维护一个 e0771-g 细胞小瓶, 其中包括在37°c、95% 湿度和 5% co 2 的细胞培养孵化器中的 10% (v/v) 胎儿牛血清 (fbs).注: 应确认细胞对支原体呈阴性反应。为此, 如上文所述 (在没有抗生素和抗菌药物的情况下), 将 e0771 细胞 (或待检测的细胞) 培养 2-3天, 收集500μl 培养基。以 12, 419 x克的速度离心培养基, 以消除细胞碎片, 并将上清液转移到新的管中。根据制造商的指示, 使用市售支原体检测试剂盒 (请参阅材料表) 和 pcr15确定支原体污染。 种子 5 x10 3 e0771-g 细胞每口井进入12孔板, 并在37°c、95% 湿度和 5% co 2 的孵化器中用 10% (v/v) 隔夜培养 fbs-dmem 细胞.注: 如果目标细胞的增殖率较低 (种群加倍时间大于 36小时), 细胞的数量可增加到 1 x 104. 将介质替换为1毫升的 10% (v/v) fbs-dmem, 包括10μgml 聚乙烯, 并添加25μl 的慢病毒颗粒 (1 x10 6 tuml), 编码核限制的红色荧光蛋白 (mkate2, 见材料表)。 在37°c、95% 湿度和 5% co2的孵化器中培养细胞24小时。 将培养基替换为 10% (v/v) fbs-dmem, 并在37°c、95% 湿度和 5% co 2 的孵化器中培养24-48 的细胞. 当细胞开始表达红色荧光蛋白时, 将培养基替换为 10% (v/v) fbs-dmem, 包括 1μgl puromycin, 并培养细胞, 直到它们融合了80-90%。注: 在靶细胞类型之间, puromycin 的浓度会有所不同, 应使用未经转染的细胞进行优化。 将存活的细胞亚培养为1-3 个通道, 用 10% (v/v) fbs-dmem (包括 1μgl puromycin), 并在液氮气相储存系统中冷冻储备储存, 直至使用。 2. 从小鼠肿瘤中分离抑制细胞 注: 在本协议中, 抑制细胞 (即mum 和 m-mdpc) 与 e0771-g 细胞建立的含有转移瘤的肺分离。组织离解和细胞分选的条件应优化, 以分离不同组织中的细胞。 将 1 x 106个癌细胞 (e0771-g) 注入异基因 (c57bl6) 的尾静脉, 雌性, 7-10 大的小鼠。 14天后, 分离含有转移性肿瘤的肺, 并准备单细胞悬浮液从灌注肺通过酶消化, 如前面所述 11.注: 在这个方案中, 四只小鼠被注射癌细胞, 他们的转移性肺被结合, 以获得足够的抑制细胞。 用抗小鼠 ccmu/cd32 抗体在冰上培养30分钟的单细胞悬浮液, 并用荧光抗体在冰上涂抹 30分钟, 用荧光抗体涂抹在 cd45、f480、cd11b、ly6c 和 Ly6C (参见材料表) 上再涂抹 30分钟10,11,13岁 用含有 2% (w/v) 的 pbs 1 ml 清洗一次染色细胞, 用含有 2% (w/v) 的 500–1000μl pbs 重新悬浮细胞颗粒。 添加3μm 的 dapi, 并对 m-mdsc 进行排序(dap/cda+ f481\80+ly6g/cd11b高Ly6G) 和 mam (dapi–cd45+ fn2\ 80 + ly6g-cd11b 高ly6c低) 使用细胞分拣器 (补充图 1)。注: ly6c 电平的阈值是根据常驻肺泡巨噬细胞 (rmac)的阈值确定的, 以区分制造 (ly6c 低) 和 m-mdcs (ly6c 高) 为基础。通过流式细胞仪测量分类细胞的纯度, 预期纯度超过90%。 用含有 20% (v/v) fbs 的 400μl dmem 重新移植分类细胞, 1% (v/v) penicilin/streptomin, 2 mm l-谷氨酰胺, 1% (v/v) 非必要氨基酸, 1 mm 丙酮酸钠, 和 50 nm 2-甲基甲醇 (称为 enriched-dmem, e-dmem)。 使用 trypan 蓝色排除方法16计数活单元的数量, 并使用 e-dmem 调整到 2 x10 6 cells/mL。 将细胞放在冰上, 直到使用。 3. 从小鼠脾脏中分离 cd8 + t 细胞 将脾脏从与目标癌细胞系 (即本协议中的 c57bl6 小鼠) 合酶上分离出来, 如下所示: 用二氧化碳吸入使动物安乐死 。 将动物放在干净的解剖板上, 用70% 的乙醇擦拭皮肤。 用剪刀割伤腹部皮肤以暴露脾脏 分离位于胃低度的脾脏, 并将其放入含有5毫升冰凉 pbs 的管中。 使用无菌5毫升注射器的内部柱塞, 在50毫升管上设置的100μm 细胞过滤器上研磨脾脏。 使用 pbs 的总10毫升将细胞通过过滤器。 以 337 x g 离心细胞悬浮液 5分钟 , 并吸入上清液。 在含有 2 mL edta 和 0.5% (w/v) bsa (运行缓冲液) 的 pbs 1 毫升中重新使用细胞颗粒, 并通过40μm 的细胞过滤器进行过滤。 计算活动单元格号, 并使用运行缓冲区调整为 1 x 108 cellse/ml。注: 保留少量的细胞作为浓缩前的样品, 以便进行纯度检查。 使用负选择试剂盒和磁性分选器 (请参阅材料表) 丰富 cd8+ t 细胞。 将脾细胞的 1 x 10 8 (1 ml) 转移到5毫升聚苯乙烯圆底管中。 加入50μl 的生物素化抗体, 在室温下孵育10分钟。 加入125μl 链霉素共轭磁珠, 在室温下孵育5分钟。 加入1.325 毫升的运行缓冲器, 然后通过移液轻轻混合。 将管子放入磁铁中, 在室温下孵育2.5 分钟。 拿起磁铁, 将浓缩的细胞悬浮液倒入新的试管中。 用200μl 的 e-dmem (即,含有 20% (v/v) fbs、1% (v/v) penicilin/streptomin、2 mm l-谷氨酰胺、1% (v/v) 非必要氨基酸、1 mm 丙酮酸钠和 50 nm 2-氨基乙醇) 的 dmem。 用 e-dmem 计数活细胞的数量, 并调整到 2 x10 6 细胞。将细胞保持在 37°c, 放在二氧化碳孵化器中, 直到使用。注: 保留少量的细胞作为浓缩后的样品, 以便进行纯度检查。 流式细胞仪测定 cd8+ t 细胞的纯度, 如下所示: 从浓缩前 (第3.6 步) 或浓缩后 (第3.9 步) 样品中提取 1 x 104个电池, 并使用运行缓冲液将每个细胞的总体积调整为100μl。 用抗小鼠 ccmu/cd32 抗体在冰上培养单个细胞悬浮液 30分钟, 用荧光抗体在 cd45、cd3、cd4 和 cd8 (参见材料表) 染色30分钟。 用含有 2% (w/v) bsa 的 500μl pbs 清洗染色细胞, 并用含有 2% (w/v) bsa 的 500–1000μl pbs 重新悬浮细胞颗粒。 加入3μm 的 dapi, 并确定 cd3+cd4–cd8+细胞在 cd45+细胞总数中的百分比. 4. 分离 cd8+ t 细胞的活化和扩展 alquot 1 x 10 5 细胞, 每 50μl cd8+ t 细胞 (在步骤3.9 中制备) 进入 u 底部96孔板的井。 每 50μl抑制细胞 (在步骤2.7 中制备) 或 50μl e-dmem 在井中添加 1个 x 10 5个细胞。 制备活化介质, 包括 e-dmem、4 x 104 uml 集落刺激因子 1 (csf-1)、240 uml 白细胞介素-2 (il-2)、8μgml 抗小鼠 cd3 抗体和16μgml 抗小鼠 cd28 抗体。注: csf-1 不是 t 细胞激活所必需的, 但对于此协议中抑制细胞 (即 mam 和 m-mdsc) 的生存至关重要。因此, 它被保留在 t 细胞与靶向癌细胞的共培养中, 以保持培养条件的一致性。由于 csf-1 在所有组织中都含有纳米摩尔浓度, 并且在体内是单环巨噬细胞活力所必需的,因此这是这些细胞的生理环境。 加入50μl 的活化介质 (步骤 4.3) 和50μl 的 e-dmem, 并对其进行检测或不添加试剂。 将板材放入37°c、95% 湿度和 5% co2的孵化器中, 培养细胞4天。 5. 与预激活的 cd8+ t 细胞共培养靶细胞的建立 在适合显微镜的平底96孔板的井中加入30μl 的1:100 稀释生长因子–减少可溶性基底膜基质 (材料表), 并在37°c 下在 co2 孵化器中孵育至少 1小时. 准备目标细胞 (即 e0771-g 细胞表示核限制的红色荧光蛋白)。 在室温下用0.05% 的胰蛋白酶 edta 对靶细胞进行1年的培养, 并通过温和的移液法收获靶细胞。 加入9毫升的 dmem, 包括 10% (v/v) fbs, 离心细胞悬浮在 337 x克5分钟。 用500μl 的 e-dmem 重新悬浮细胞, 并计算活细胞的数量。注: 在计算目标细胞之前, 通过40μm 的电池过滤器对细胞进行过滤, 以产生单个细胞悬浮液。 通过添加 e-dmem,将密度调整为 2 x 10 4 cellsl (= 每 50μl1 x 10 3细胞), 并将细胞保持在冰上。 准备效应细胞 (即预激活的 cd8+ t 单元)。 通过移液将96孔板 (步骤 4.5) 中的细胞彻底重新移植, 并将浮动的 cd8+ t 细胞转移到新的 1.5 ml 管中。注: mam 和 m-mdcs 紧紧地粘附在井上, 不会被移液器分离。 为了收集剩余的细胞, 在井中加入200μl 的 pbs, 并在5.3.1 的步骤转移到试管中。 用 e-dmem 1 毫升 (337 x g 的离心机) 清洗细胞 5分钟, 吸气并丢弃上清液), 并用 100μl e-dmem 重新悬浮细胞。 计数活细胞的数量 (使用色氨酸蓝色排除方法), 将密度调整为 1.6 x10 5 细胞 (= 4 x10 3 cellss\ 25μl), 并将细胞保持在冰上。 在步骤5.1 中从板的每口井中吸气基底膜基质。 在每口井中加入 1 x 10 3 细胞50μl 的靶细胞 (步骤 5.2.4), 搅拌均匀。注: 为避免介质蒸发引起的边缘效应, 应仅使用96井板的内部60口井进行分析。 加入 25μl e-dmem, 包括 4 x10 3 ueml il-2 和10μm 荧光型 caspase-3 基板 (参见材料表)。 将 4 x10 3 细胞/cd8 + t 细胞 (步骤 5.3.4) 加入适当的井中, 搅拌良好。注: 井中存在过多的细胞会增加分析的难度。在该模型中, 4: 1 效应因子: 目标比 (总细胞数 5 x10 3 cells/well well) 是最优的, 但81:1 的比率是次优的。需要包含以下四个控制的井有助于数据分析: 用于共培养井 (1 x10 3 cells井) 的密度的目标细胞, 在培养基中与卡斯帕西-3 底物和不含有卡斯帕西-3 底物的目标细胞, 效应细胞 (1 x10 3 细胞)在介质中具有和不带卡斯帕西-3 基板。 在所有空井 (特别是板周围的井) 中加入200μl 的 pbs 或无菌水, 以减少实验井中介质的蒸发。 将印版设置为延时荧光显微镜, 该显微镜保持在37°c、95% 湿度和 5% co2。注: 以交叉模式摇晃板, 使所有细胞均匀分布, 然后让板在室温下保持在平坦表面上 10-20, 然后转移到孵化器。 6. 细胞成像 注: 详细的图像采集设置将因使用的显微镜和荧光而异;为了获得最佳结果, 应采用以下一般采集参数。 在显微镜下使用适当的自动对焦例程, 获取覆盖96孔板每个实验井总表面积至少25% 的图像。 设置显微镜以获取相对比的图像, 以及适用于核限制红色荧光蛋白 (mkate2) 的荧光通道和适用于绿色荧光活性 case-3 基板的荧光通道 ((图 2)。 每1至3小时捕获实验井中的图像, 时间至少为72小时。 7. 使用图像分析软件进行图像分析 注: 详细的图像分析设置将因所使用的软件而异 (请参阅材料表);应采用以下一般分析程序, 以获得最佳结果。 确定是否需要光谱非混合来分离目标细胞核发出的荧光信号和凋亡核发出的荧光信号, 并在必要时建立分析协议以实现这一目标; 查看在绿色荧光通道中没有通道中没有通道中的 c s 皮亚斯-3 基板的介质中只包含目标细胞 (mkate2-tat 标记) 的控制井。 观察红色原子核 (原子核呈绿色) 是否发出绿色荧光 如果绿色荧光在原子核中明显可见, 请访问成像软件中的光谱解混合控制, 并增加从绿色中去除的红色百分比, 直到绿色信号消失 (根据我们的经验, 这通常是6-7 的明亮 mkate2荧光)。 如果绿色荧光在任何原子核中都不明显, 则不需要光谱解混。注: 这种光谱不混合校正试验也可以使用含有卡斯帕西-3 基板介质中的目标细胞井进行。然而, 目标细胞的自发凋亡水平通常很低 (不到 10%), 导致一些靶向细胞核由于激活的酪蛋白酶-3 而不是荧光出血而发出绿色荧光。在这些条件下, 当绿色荧光在所有原子核中都是明显的时, 真正的荧光出血是明显的。 查看在红色和绿色通道中没有通道中的无通道中的基板中仅含有效应细胞 (未标记的细胞核) 的控制井。 观察原子核是否发出绿色或红色荧光。如果红色和绿色荧光在各自的渠道是不明显的没有光谱解开是必要的。注: 根据我们的经验, 鼠标 cd8+ t 细胞不是自动荧光的, 因此这些细胞不需要光谱解混。这种光谱解混校正试验也可以使用含有酪醚-3 基板的介质中的效应电池井进行。然而, 通常有一定程度的自发凋亡, 导致效应细胞核发出绿色荧光, 由于激活的酪蛋白-3。在这些条件下, 当绿色荧光在所有原子核中都是明显的时, 真正的荧光出血是明显的。 使用荧光背景减法 (例如 tophat), 并为样本提供相关参数, 以解决两个荧光通道中的荧光物体。注: 在绿色通道中, 我们使用了 tophat (原子核半径 = 10.0μm, 绿色荧光阈值 = 0.7个绿色校准单元)。在红色通道中, 我们使用了 tophat (原子核半径 = 10.0μm, 红色荧光阈值 = 0.5 红色校准单元)。 使用适当的边缘分裂参数来解决单个荧光核。注: 我们没有在绿色或红色荧光通道中使用边缘分裂。 使用仅包含目标细胞的井 (带有酪蛋白酶底物) 的红色通道中的图像来确定目标核的最小大小。注: 我们使用了 80μm2。 使用仅含有效应细胞的井 (含酪蛋白基板) 的绿色通道中的图像来确定凋亡效应核的平均大小。注: 在这些实验中, 单凋亡效应核的范围为40–80微米2 。 建立一个分析程序, 使用适当的最小尺寸限制 (例如, 最小面积、最小直径) 来计算荧光靶核的数量 (图 2, 目标检测掩码)。注: 我们使用了最小核子面积 (红色荧光) = 80μm2。 建立一个分析程序来计算凋亡细胞核的数量, 这些细胞核的大小大于凋亡效应核的平均大小 (图 2, 大小受限凋亡掩码)。注: 尺寸过滤器设置为 80μm2 (即只计算出大于此尺寸的绿色荧光区域, 因此不包括单个凋亡效应核)。利用这些参数可以提高分析的准确性, 计算凋亡靶核, 虽然一些凋亡效应细胞的集合体可以计数。 建立一个分析程序, 通过计数细胞核来计算凋亡靶细胞的数量, 其中红色荧光信号 (从步骤 7.6) 和大小限制绿色荧光信号 (从步骤 7.7) 显著地共定位 (图2, r重叠掩码)。注: 适当的联合定位范围可能从目标核平均大小的30% 到100% 不等。重叠尺寸过滤器设置为 40μm 2。 确定每个实验条件下每个实验过程中凋亡靶核的数量以及井内的靶细胞核数。 8. 使用计算和绘图软件进行数据分析 绘制实验井在整个时间过程中在步骤7.9 中获得的凋亡靶核数。如果在每个实验条件下使用多个井, 则以图形方式将结果显示为均值±标准偏差。 通过将每口井中的凋亡细胞数量除以每个时间点每口井中的目标细胞数量来计算目标细胞种群的凋亡分数。 绘制步骤8.2 中获得的结果图。 确定每个曲线的曲线下区域 (auc)。如果需要, 也可以确定每条曲线的种群凋亡分数的峰值以及峰值发生的时间点。使用适当的统计测试确定为实验条件确定的 auc 是否有显著差异。注: 未配对的 t 检验与 welch 的校正应用于 auc 的结果。