실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된⁺ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

관련 된 생쥐에 실시 했다 모든 절차 허가 영국 홈 오피스 (P526C60B3)에서 허가. 상업적인 시 약 및 장비에 대 한 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 1. 그들의 핵에 빨간색 형광 단백질을 표현 하는 대상 셀의 준비 적절 한 소스에서 대상 마우스 암 세포 라인을 얻을.참고:이 프로토콜에서 E0771 마우스 유 방 종양 세포 (E0771-LG)13 의 높은 전이성 파생 사용 됩니다. 보호자 E0771 셀 C57BL/6 마우스14에서 시작 됩니다. 해 동 고와 Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 셀 문화 인큐베이터에서 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하 여 E0771-LG 셀의 유리병을 유지 합니다.참고: 그것은 확인 되어야 한다 세포는 mycoplasma에 대 한 부정적. 이 위해, 2-3 일 문화 매체의 수집 500 μ (없을 경우에 항생제와 antimycotics), 위에서 설명한 대로 E0771 셀 (또는 셀 테스트) 문화. 12,419 x g 60에 매체 원심 세포 파편을 제거 하 고 상쾌한 새로운 튜브로 전송 하는 s. Mycoplasma 오염 상용 mycoplasma 테스트 키트를 사용 하 여 결정 ( 테이블의 자료를 참조) 또는 PCR15 제조업체의 지침에 따라. 12 잘 플레이트, 그리고 문화에서 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2배양 기에서 하룻밤 사이 10% (v/v) FBS DMEM 셀에 잘 당 씨앗 5 x 103 E0771-LG 셀.참고: 대상 셀의 확산 속도가 낮은 경우 (인구 36 h 보다 큰 시간을 두 배로), 1 x 104셀의 수를 늘릴 수 있습니다. 10% (v/v) FBS DMEM 10 μ g/mL polybrene를 포함 하 여 1 mL와 매체를 대체 하 고 추가 25 μ lentiviral 입자 (1 x 106 화/mL)의 빨간 형광 단백질을 제한 핵 인코딩 (mKate2, 테이블의 자료를 참조). 37 ° C, 습도 95%와 5% CO2배양 기에서 24 h에 대 한 셀을 문화. 10% (v/v) FBS DMEM 매체를 대체 하 고 37 ° C, 습도 95%와 5% CO2배양 기에서 24-48 h에 대 한 셀을 문화. 10% (v/v) FBS DMEM 셀 시작 빨간 형광 단백질을 표현 하 고 그들은 80-90% 합칠 때까지 셀 문화 1 μ g/mL puromycin를 포함 하 여 매체를 바꿉니다.참고: puromycin의 농도 목표 세포 유형 사이 다른 되며 취소 transfected 세포를 사용 하 여 최적화 합니다. Subculture에 살아남은 10% (v/v) FBS DMEM 1 μ g/mL puromycin를 포함 하 여 1-3 구절에 대 한 세포 및 사용까지 주식 액체 질소 증기 위상 스토리지 시스템에 cryopreserve. 2. 마우스에서 종양의 억제 세포의 고립 참고:이 프로토콜에서 억압 셀 (즉, MAMs M MDSCs) E0771-LG 셀에 의해 설립 하는 전이성 종양을 포함 하는 폐에서 격리 됩니다. 조직 분리와 세포 분류는 다른 조직에서 세포를 분리 최적화 되어야 합니다. 1 x 106 암 세포 (E0771-LG) syngeneic (C57BL/6), 여성, 7-10 주 오래 된 쥐의 꼬리 정 맥에 주사. 14 일 후 전이성 종양을 포함 하는 폐를 분리 하 고 앞에서 설명한11으로 효소 소화를 통해 perfused 폐에서 단일 셀 정지를 준비 합니다.참고:이 프로토콜에서 4 개의 마우스는 주입 암 세포 그리고 그들의 전이성 폐 충분 한 억제기 세포를 얻기 위해 결합 됩니다. 얼음에 30 분 동안 반대로 마우스 CD16/CD32 항 체와 단일 셀 정지 품 어 하 고 또 다른 30 분10,11 CD45, F4/80, CD11b, Ly6C, 및 Ly6G ( 테이블의 자료를 참조)에 형광 성 항 체와 얼룩 , 13. 포함 하는 2% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA), PBS의 1 mL를 한번 스테인드 셀을 세척 하 고 다시 2% (w/v) BSA 포함 하는 PBS의 500-1000 μ와 셀 펠 릿을 일시 중단. DAPI의 3 μ M를 추가 및 정렬 M MDSCs (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11b높은Ly6C높은)와 MAMs (DAPI-CD45++Ly6G F4/80-CD11b높은 Ly6C낮은) 셀 정렬 (보충 그림 1)를 사용 하 여.참고: MAMs (Ly6C낮은)와 M-MDSCs (Ly6C높은) 구별을 Ly6C 수준 임계값 기반 거주 치경 대 식 세포 (RMAC)의. 정렬된 셀의 순도 90% 이상의 예상된 순수성을 가진 cytometry 통해 측정 됩니다. 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) 페니실린/스, 2 m L-글루타민, 1% (v/v) 비 필수 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, m 및 50 nM 2-mercaptoethanol (농축 DMEM, E DMEM 라는) 포함 된 DMEM의 400 μ와 정렬된 셀 resuspend Trypan 블루 제외 방법16 를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하 고 2 x 106 셀/E DMEM mL를 조정 합니다. 사용까지 얼음에 셀을 계속. 3. 절연 CD8의+ T에서 쥐의 비장 세포 다음과 같이 대상 암 세포 라인 (즉, 이 프로토콜에 C57BL/6 쥐)에 syngeneic은 마우스에서 비장 격리: CO2 흡입 하 여 동물을 안락사. 깨끗 한 절 개 보드에 동물을 놓고 70% (v/v) 에탄올과 피부를 닦아. 가 위를 사용 하 여 비장을 노출 하는 복 부 피부를 잘라 비장, 위장에 열 등 한 위치, 분리 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 튜브에 배치. 살 균 5 mL 주사기의 내부 플런저를 사용 하 여 100 μ 셀 거르는 50 mL 튜브에 설정에 비장 갈기. PBS의 총 10 mL를 사용 하 여 필터를 통해 세포를 전달 합니다. 337 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한 발음. 1 ml의 PBS 2 mM EDTA와 0.5% (w/v) BSA (버퍼를 실행 하는)를 포함 하는 셀 펠 릿 resuspend 고 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 합니다. 라이브 셀 수를 계산 하 고 1 x 108 셀/ml 실행 버퍼를 사용 하 여 조정 합니다.참고: 작은 유지 순도 검사에 대 한 사전 농축 샘플 셀의 aliquot. CD8을 풍요롭게+ T 세포의 부정적인 선택 키트를 사용 하 여 자기 정렬 ( 테이블의 자료를 참조). Splenocytes 셀의 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브 1 x 108 (1 mL)을 전송. Biotinylated 항 체의 50 μ를 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어. 활용 하는 streptavidin 자석 구슬의 125 μ를 추가 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 버퍼, 실행의 1.325 mL을 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합. 자석에 튜브를 배치 하 고 2.5 분 동안 실 온에서 품 어. 자석를 선택 하 고 새 튜브로 풍부한 세포 현 탁 액을 붓는 다. 200 μ E DMEM의 풍부한 셀 resuspend (즉,., 20% (v/v) FBS, 포함 된 DMEM 1% (v/v) 페니실린/스, 2 mM L-글루타민, 1% (v/v) 비 필수 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, 및 50 nM 2-mercaptoethanol). 라이브 셀의 수를 계산 하 고 2 x 106 셀/E DMEM mL를 조정 합니다. 셀 37 ° C에서 CO에2 인큐베이터까지 계속 사용.참고: 작은 유지 순도 검사 후 농축 샘플 셀의 aliquot. CD8의 순도 결정+ T 세포 cytometry에 의해 다음과 같이: 사전 농축 (단계 3.6)에서 1 x 104 의 세포 또는 후 농축 (단계 3.9) 샘플을가지고 고 실행 버퍼를 사용 하 여 100 μ를 각각의 총 볼륨을 조정. 얼음에 30 분 동안 반대로 마우스 CD16/CD32 항 체와 단일 셀 정지 품 어 하 고 또 다른 30 분을 CD45, CD3, CD4, CD8 ( 테이블의 자료를 참조) 형광 항 체와 얼룩. 2% (w/v) BSA를 포함 하는 PBS의 500 μ와 스테인드 셀을 세척 하 고 다시 2% (w/v) BSA 포함 하는 PBS의 500-1000 μ와 셀 펠 릿을 일시 중단. DAPI의 3 μ M을 추가 하 고 c d 3의 비율을 결정+CD4-CD8 총 CD45에 셀+ + 세포 인구. 4. 활성화 및 격리 된 CD8의 확장+ T 세포 50 μ 당 aliquot 1 x 105 세포 CD8+ T U-하단 96 잘 접시의 우물으로 (단계 3.9에서에서 준비) 세포. (단계 2.7에서에서 준비) 50 μ 억제기 세포 당 1 x 105 셀 추가 또는 우물에의 전자 DMEM 50 μ. E-DMEM, 4 × 104 U/mL 식민지 자극 요소 (CSF-1) 1, 240 U/mL interleukin-2 (일리노이-2), 8 μ g/mL 반대로 마우스 CD3ε 항 체, 및 16 μ g/mL 반대로 마우스 CD28 항 체의 구성 된 정품 인증 매체를 준비 합니다.참고: CSF-1 T 세포 활성화를 위해 필요 하지 않습니다 하지만이 프로토콜 (MAMs 및 M MDSCs) 억제기 세포의 생존을 위해 필수적 이다. 따라서, 그것은 문화 조건에 일관성을 유지 하기 위해 대상 암 세포와 T 세포의 공동 문화에 그대로 유지 됩니다. CSF-1 나노-모 랄 농도 모든 조직에서 발견 되 고 monocyte/대 식 세포 생존 vivo에서, 필요 때문이이 셀에 대 한 생리 적 맥락 이다. 50 μ 활성화 중간 (단계 4.3)의 추가 함께 또는 테스트 시 약 없이 전자 DMEM의 50 μ. 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2 에서 인큐베이터에 접시를 놓고 4 일 셀 문화. 5. 설치 대상의 공동 문화의와 전 활성화 한 CD8 세포+ T 세포 1: 100 희석된 증가율 감소 성 지하실 멤브레인 매트릭스 (자료 테이블)의 30 μ 플랫 바닥 96 잘 접시 현미경 검사 법, 적합의 우물에 추가 하 고 적어도 1 시간에 대 한 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 대상 셀 (즉, E0771-LG 제한 핵 빨간 형광 단백질을 표현)을 준비 합니다. 1 분 동안 실 온에서 0.05 %trypsin / EDTA의 1 mL와 대상 셀을 품 어 그리고 부드러운 pipetting으로 세포를 수확. DMEM 10% (v/v) FBS를 포함 하 여 9 mL을 추가 하 고 5 분 동안 337 x g 에 세포 현 탁 액을 원심. 다시 E-DMEM의 500 μ 셀을 일시 중지 및 라이브 셀 수 있습니다.참고: 계산 하기 전에 대상 셀 필터링 셀 단일 세포 현 탁 액을 생산 하는 40μm 셀 스 트레이너를 통해. E-DMEM을 추가 하 여 2 × 104 셀/mL (= 당 50 μ 1 x 103 셀)를 밀도 조정 하 고 얼음에 셀을 계속. 효과 기 세포를 준비 (즉, 전 활성화 CD8+ T 세포). Resuspend+ T pipetting, 전송 부동 CD8 철저 하 여 96 잘 접시 (4.5 단계)의에 셀 새로운 1.5 mL 튜브에 세포.참고: MAMs M MDSCs 단단히 잘 준수와 pipetting에 의해 분리 되지. 남아 있는 세포를 수집 하려면 우물에 PBS의 200 μ를 추가 하 고 단계 5.3.1에서에서 튜브로 전송 합니다. 셀 E DMEM 한번 (337 x g에서 원심 분리기)의 1 mL을 5 분, 발음 그리고 세척 상쾌한 삭제), E-DMEM의 100 μ와 resuspend 및. (Trypan 블루 제외 메서드를 사용 하 여) 라이브 셀의 수를 계산, 1.6 x 105 셀/mL (= 4 x 103 셀/25 μ), 밀도 조정 하 고 얼음에 셀을 계속. 5.1 단계에서 격판덮개의 각 우물에서 지하실 멤브레인 매트릭스 발음 각 잘으로 대상 셀 (5.2.4 단계)의 1 x 103 셀/50 μ를 추가 하 고 잘 혼합.참고: 잘 매체, 96의 내부 60 우물만의 증발 때문에 지 효과 피하기 위해 접시는 분석을 위해 사용 될 해야 합니다. 25 μ E DMEM 4 x 103 U/mL 일리노이-2와 10 μ M fluorogenic caspase 3 기판 ( 테이블의 자료를 참조)를 포함 하 여의 추가 합니다. 4 x 103 셀/25 μ CD8의 추가+ T 세포 (단계 5.3.4)에 우물에 적절 한와 섞어 잘.참고: 잘에서 너무 많은 세포의 존재 때문에 분석 더 어렵다. 이 모델, 4:1 이펙터: 대상 비율 (총 셀 번호 5 x 103 셀/잘) 최적 이었지만 8:1 비율 차선. 웰 스는 다음과 같은 네 개의 컨트롤을 포함 하는 데이터 분석을 원조 하는 데 필요한: 셀 공동 문화 웰 스 (1 x 103 셀/잘) 매체와 caspase 3 기판 없이 사용 밀도에서 이펙터 (1 x 103 셀을 대상 / 잘)와 caspase 3 기판 없이 매체에. 실험적인 우물에서 매체의 증발을 줄이기 위해 모든 빈 우물 (접시의 주변에서 특히 우물)에 PBS 또는 살 균 물 200 μ를 추가 합니다. 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 유지 되는 시간 경과 형광 현미경으로 접시를 설정 합니다.참고: 균등 모든 셀, 크로스-패턴에 접시를 흔들어 고 인큐베이터에 전송 하기 전에 10-20 분에 대 한 평평한 표면에 실내 온도에 유지 하는 접시. 6. 셀의 이미징 참고: 자세한 이미지 수집 설정 현미경 및 사용; fluorophores 달라 집니다. 다음 일반 인수 매개 변수는 최적의 결과 대 한 고용 한다. 현미경에 적합 한 자동 루틴을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 실험 잘에서 총 면적의 적어도 25%를 덮고 이미지 획득. 현미경 단계 대조로 형광 채널 제한 핵 빨간 형광 성 단백질 (mKate2)에 대 한 적합 한 이미지를 설정 하 고 녹색 fluorogenic에 대 한 적합 한 형광 채널 활성화 (caspase 3 기판 여기에서 488 nm) (그림 2). 단계 대조에 적어도 72 h에 대 한 모든 1 ~ 3 h 2 형광 채널 실험 우물에서 이미지를 캡처하십시오. 7. 이미지 분석 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 참고: 자세한 이미지 분석 설정을 사용 하는 소프트웨어와 함께 달라 집니다 ( 테이블의 자료를 참조); 최적의 결과 대 한 다음과 같은 일반적인 분석 절차를 채택 한다. 스펙트럼 확인 취소 혼합 분리 형광 신호에서 대상 셀 핵에서 방출 되는 apoptotic 핵에서 방출 되 고 필요한 경우이; 분석 프로토콜을 설정 하는 데 필요한 보기 컨트롤 잘만 대상 세포 (mkate2 표시 된) 녹색 형광 채널에서 caspase 3 기판 없이 매체에 포함 된. 녹색 형광 적색 핵 (핵 표시 녹색)에 의해 방출 되는 여부 관찰 핵에서 녹색 형광 이면 액세스 이미징 소프트웨어에 스펙트럼 unmixing 제어 및 녹색에서 녹색 신호 사라질 때까지 제거 하는 빨간색의 비율 증가 (우리의 경험에서는, 이것은 일반적으로 밝은 mKate2에 대 한 6-7% 형광)입니다. 녹색 형광 어떤 핵에서 명백 하지 않으면 아무 스펙트럼 unmixing은 필요 합니다.참고:이 스펙트럼 unmixing 보정 테스트 또한 매체 포함 된 caspase 3 기판에에서 대상 셀의 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 통해 형광 보다는 caspase 3 출혈의 활성화 때문에 녹색 형광을 방출 하는 몇 가지 대상 셀 핵 인 대상 세포 (10% 미만), 자발적인 apoptosis의 매우 낮은 수준이 이다. 통해 진정한 형광 흘릴 때 녹색 형광은 모든 핵에서 이러한 조건 하에서 분명 하다. 빨강 및 녹색 채널에 caspase 3 기판 없이 매체에 잘만 효과 기 세포 (핵 레이블 없음)를 포함 하는 컨트롤을 개별적으로 볼. 녹색 또는 빨간색 형광 핵에 의해 방출 되는 여부를 관찰 합니다. 빨간색도 녹색 형광은 개별 채널에 아무 스펙트럼 unmixing 경우 필요.참고: 우리의 경험, CD8 마우스에서+ T 세포는 자동 형광 이며 따라서 아무 스펙트럼 unmixing이 세포에 필요한. 이 스펙트럼 unmixing 보정 테스트 매체 포함 된 caspase 3 기판에에서 효과 기 세포의 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 자발적인 apoptosis caspase 3의 활성화 때문에 녹색 형광을 방출 하는 이펙터 세포 핵에 결과의 몇 가지 수준이 이다. 통해 진정한 형광 흘릴 때 녹색 형광은 모든 핵에서 이러한 조건 하에서 분명 하다. 형광 두 채널에 형광 개체를 해결 하려면 샘플에 대 한 관련 매개 변수 형광 배경 빼기 메서드 (예: TopHat)를 사용 합니다.참고: 녹색 채널에 우리 사용 TopHat (핵 반지름 = 10.0 µ m, 녹색 형광 임계값 = 0.7 녹색 교정 단위). 빨강 채널에서 TopHat 사용 (핵 반지름 = 10.0 µ m, 빨간색 형광 임계값 = 0.5 레드 보정 단위). 가장자리-분할에 대 한 적절 한 매개 변수를 사용 하 여 개별 형광 핵 해결.참고: 우리가 가장자리에 녹색 또는 빨간색 형광 채널 분할을 사용 하지 않았다. 이미지를 사용 하 여 대상 핵의 최소 크기를 결정 (caspase 기판)와 대상 셀만 포함 하는 우물에서 빨강 채널에서.참고: 우리는 80 µ m2를 사용합니다. Apoptotic 이펙터 핵의 평균 크기를 결정 (caspase 기판)와 이펙터 셀만 포함 하는 우물에서 녹색 채널에서 이미지를 사용 합니다.참고: 단일 apoptotic 이펙터 핵이이 실험에서 40-80 µ m2 에서 배열 했다. (예를 들어, 최소 공간, 최소 직경) 적절 한 최소 크기 제한을 사용 하 여 형광 대상 세포 핵의 수를 계산 하는 분석 절차 설정 (그림 2, 대상 검출 마스크).참고: 우리가 사용 하는 최소 핵 지역 (레드 형광) = 80 µ m2. Apoptotic 핵 apoptotic 이펙터 핵 (그림 2, 크기 제한 apoptosis 마스크)의 평균 크기 보다 큰 수를 계산 하는 분석 절차를 설정 합니다.참고: 크기 필터 80 µ m2 로 설정 (즉, 유일한 지역 녹색 형광이이 크기 보다 큰의 세어 졌다, 따라서 단일 apoptotic 이펙터 핵을 제외). 이러한 매개 변수를 사용 하 여 apoptotic 효과 기 세포의 일부 집계 계산 될 수 있지만 apoptotic 대상 셀 핵 계산에서 분석의 정확도 증가 한다. 분석 절차를 설정 apoptotic 대상 셀 의 수를 계산 하는 핵을 계산 하 여 어디 (에서 단계 7.6) 빨간 형광 신호 및 (단계 7.7)에서 녹색 형광 신호 크기 제한 크게 공동 지역화 (그림 2, R /G 중복 마스크)입니다.참고: 적절 한 공동 지역화 대상 핵의 평균 크기의 100%를 30%에서 범위 수 있습니다. 오버랩 크기 필터 40 µ m2로 설정 되었습니다. 전체 시간에 걸쳐 apoptotic 대상 세포 핵의 수 뿐만 아니라 각 실험 조건에 대 한 우물에 대상 세포 핵의 수를 결정 합니다. 8. 데이터 분석 사용 하 여 계산 하 고 그래프 소프트웨어 Apoptotic 대상 셀 핵 실험 웰 스에 대 한 전체 시간에 걸쳐 단계 7.9에서에서 얻은 수 그래프. 각 실험 조건에 대해 여러 우물 사용, 그래픽 결과 ± 표준 편차 의미를 제시. 각 잘 각 잘 각 시간 지점에서 대상 셀의 수에 의해 apoptotic 세포의 수를 분할 하 여 대상 셀의 인구는의 apoptotic 분수를 계산 합니다. 8.2 단계에서 얻은 결과 그래프. 각 곡선 (AUC) 곡선 아래의 영역을 결정 합니다. 원하는 경우 각 곡선의 모집단의 피크 apoptotic 분수 또한 피크 발생 시간 포인트 뿐만 아니라 결정 될 수 있습니다. 실험 조건에 대 한 결정 AUC 크게 다른 적절 한 통계적 테스트를 사용 하 여 여부를 결정 합니다.참고: 웰 치의 보정으로 짝이 없는 t-검정 AUC 결과에 적용 되었습니다.