Her presenterer vi den detaljert prosedyren en nylig utviklet protease analysen plattform N-terminal hexahistidine maltose-binding protein og fluorescerende protein-smeltet rekombinant underlag festet til overflaten av nikkel-nitrilotriacetic Acid magnetiske agarose perler. En påfølgende i-gel analyse av analysen prøvene med natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese er også presentert.
Proteaser er intensivt studerte enzymer på grunn av deres viktige roller i flere biologiske banene levende organismer og patogenesen; Derfor er de stoffet mål. Vi har utviklet en magnetisk-agarose-perle-baserte analysen plattform for etterforskningen av proteolytisk aktivitet, som er basert på bruk av rekombinant fusion protein underlag. For å demonstrere bruk av denne analysen systemet, presenteres en protokoll på eksempel på humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) protease. Introdusert analysen plattformen kan brukes effektivt i biokjemiske karakterisering av proteaser, inkludert enzym aktivitet målinger i mutagenese, kinetic, hemming eller spesifisitet studier, og det kan være egnet for høy gjennomstrømming substrat screening eller kan tilpasses andre proteolytiske enzymer.
I denne analysen system, anvendt substrater inneholder N-terminal hexahistidine (hans6) og maltose bindende protein (MBP) koder, cleavage nettsteder for tobakk etse virus (TEV) og HIV-1 proteaser og en C-terminalen fluorescerende protein. Substrater effektivt kan produseres i Escherichia coli celler og renset lett med nikkel (Ni) – chelate – belagt perler. Under analysen fører proteolytisk spalting av perle-vedlagt underlag til utgivelsen av fluorescerende cleavage fragmenter, som kan måles ved fluorimetry. I tillegg kan cleavage reaksjoner analyseres av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). En protokoll for i-gel-renaturation analysen komponenter er også beskrevet som delvis renaturation fluorescerende proteiner gjør gjenkjenningen basert på molekylvekt og fluorescens.
Proteolytiske enzymer tilhører de mest intenst undersøkt enzym gruppene på grunn av deres betydning i metabolske veier og industrielle applikasjoner, samt. Deres sentrale rolle i sykdommer, regulering av blodpropp, kreft, og hjerte og nevrodegenerative sykdommer gjør proteaser fremtredende mål innen medisiner. Derfor, detaljert karakterisering av underlaget spesifisitet og hemmer profilere protease (PR) rundt er avgjørende og utføres fortrinnsvis av rask, kostnadseffektiv og robust biokjemiske analyser1,2, 3.
I dag, det store flertallet av i vitro protease analyser brukes i feltet i stoffet funnet for sammensatte profilering er homogen, fluorescerende peptid-baserte og høy gjennomstrømming screening (HTS)-kompatible plattformer4. Videre merket peptider er ikke bare egnet for biblioteket screening, men de tilbyr også gode verktøy for fastsettelse av enzymet kinetic parametere for de valgte underlag. I andre tilfeller der merking av underlaget ikke er mulig, kan separasjonsbaserte analyser gi en mulig løsning for å vurdere kinetic egenskapene proteolytisk reaksjoner3.
Vanligvis i vitro protease analyser er basert på bruk av to typer substrat: korte peptider eller hele proteiner. I de tilfellene der i spalting av kort peptid sekvenser gjenspeiler egenskapene cleavage tilstrekkelig, følgende standard fremgangsmåter gjelder: (i) å undersøke standard protein underlag som oksidert insulin B-kjeden, (ii) testing kommersielt tilgjengelige underlag av andre proteaser, (iii) screening syntetiske og fluorescently merket peptid biblioteker av kombinasjon kjemi, eller (iv) med genetiske metoder, for eksempel biologisk vise teknologier5, 6. Konvensjonelle klassifiseringen, andre roman plattformer er også tilgjengelig for substrat generasjon (f.eks dannelsen av proteom-avledet peptid biblioteker7 eller spesielle undergrupper av genetiske metoder, som rekombinant fusjon protein-basert underlag8,9,10,11,12).
Alle de ovennevnte substrat typer og analyser har sine egne fordeler og begrensninger, og utviklingen av analysen formater kombinere og/eller forbedre fordelene av kjente plattformene er fortsatt etterspurt. Her beskriver vi en protokoll for en separasjonsbaserte fluorescerende protease analysen, som utnytter rekombinant underlag. Disse fusion proteinene består av6 og MBP tags smeltet sammen til en kontroll cleavage nettsted TEV PR, som er etterfulgt av underlaget sekvensen av interesse som er direkte koblet til en C-terminalen fluorescerende protein (FP) (figur 1A). Kloning av en DNA sekvens koding for en kløv område av interesse i ‘kloning kassetten’ kan utføres av en enkelt ligatur reaksjon i uttrykket plasmider, som har vært linearized tidligere av begrensning endonucleases.
Figur 1: Prinsippet om fluorescerende protease analysen. (A) den skjematisk fremstilling av en fluorescerende substrat og dens spalting av humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) protease vises. Pilen viser cleavage posisjon innenfor matrise/kapsid cleavage området sekvensen HIV-1 protease (VSQNY * PIVQ). (B) den selvlysende fargen underlag kan brukes å analysere enzymreaksjoner av Ni-NTA magnetisk-perle-baserte analysen og polyakrylamid gel geleelektroforese, også, som vises i Arbeidsflytdiagrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Selv om proteolytisk analyser med lignende rekombinante proteiner underlag som inneholder en affinitet kode, et proteolytisk cleavage nettsted og en fluorescerende protein-ha allerede blitt beskrevet8,9,10, systemet presenteres her har til hensikt å integrere og forbedre fordelene av disse metodene. En viktig forskjell er at fusion protein substrater i denne analysen plattformen er utstyrt med MBP å forbedre protein løselighet13 og inneholde en kontroll cleavage nettsted for TEV PRs. Videre inneholde substrater ny generasjon fluorescerende proteiner, som er svært stabil og har en monomerisk form for å hindre substrat aggregering. Foruten tidligere publiserte anvendelse av mTurquoise2 – og mApple-smeltet skjemaer14vise her vi også resultatet gitt ved bruk av en rekombinant substrat som inneholder en monomerisk forbedret gule fluorescerende protein (mEYFP) fluorescerende tag. Herved vi viser kompatibiliteten til systemet med andre fluorescerende proteiner og representerer noen generelle typer resultater som kan oppnås med protease analysen.
Rekombinant fusion proteiner er uttrykt i E. coli BL21(DE3) celler og brukes som underlag for analysen i en nikkel-nitrilotriacetic syre (Ni-NTA)-belagt magnetiske agarose-perle-tilknyttet skjema. C-terminalen cleavage produktene er frigjort fra perle overflaten i nedbryting på spalting av protease rundt. Etter separasjon av nedbryting (inneholder enzymet og cleavage produktene) fra de magnetiske perlene, kan fluorescensen bli målt for å fastsette egenskapene spalting av enzymet. I motsetning til metodene beskrevet tidligere er i systemet presenteres her, mengden substrat og C-terminalen cleavage produkter unikt kvantifisert basert på en detaljert substrat kalibreringsprosedyren. Analysen systemet kan støttes av en SDS side analyse av analysen prøver; en etterfølgende fluorescerende i-gel visualisering kan brukes umiddelbart etter geleelektroforese eller i-gel-renaturation av nondenatured og denaturert fluorescerende komponentene, henholdsvis14.
Fleksibilitet og struktur av ‘kloning kassetten’ tillate en tid – og kostnadseffektiv innsetting av en rekke ulike sekvenser i Konstruer og dermed fremmer generering av underlaget biblioteker. Siden alle analysen er og HTS-automatiseringskompatibelt, kan systemet være spesielt attraktivt for, for eksempel protease spesifisitet mål og mutagenese studier, eller det kan også effektivt benyttes for industriell protease hemmer screening og/eller antiviral stoffet utvikling, også.
Enzym kinetic parametere (kkatten, K–m) kan bestemmes av utviklet separasjonsbaserte analysen; Det kan derfor være egnet til å utføre enkelte enzym kinetic målinger, som tid-kurset, substrat-avhengige og hemming studiene. Dette beviser at rekombinant fusion protein substrater gir gode alternativer for ofte benyttet syntetiske oligopeptide underlag, og på grunn av deres høye likhet med polyprotein substrater, de representerer den naturlig forekommende enzym-underlaget interaksjoner mer nøyaktig.
Intensiv industri og akademiske undersøkelser av proteolytiske enzymer og det konstante behovet for rask og rimelig HTS-kompatible protease analysen plattformer derfor har vi utviklet en magnetisk-perle-baserte fluorescerende protease analysen. Analysen er basert på bruk av rekombinant fusion proteiner som kan være romanen alternativer til mye benyttet syntetiske peptid substrater.
I formatet utviklet analysen er fusion protein substrater immobilisert til overflaten av Ni-chelate-belagt magnetiske agarose perler. Substrat vedlegget er levert av N-terminalen sin6 affinitet tag fusion protein, som er direkte smeltet en MBP merke for å forenkle den folding og forbedre vannløselighet substrat13. MBP etterfølges av cleavage områder av TEV PR og en protease rundt. Den tidligere kan tjene som en kontroll cleavage nettsted i analysen, mens sistnevnte kan behandles av protease undersøkes. Området Kløv er utskiftbare; en kort dsDNA sekvens koding for spalting området rundt kan settes inn i den fleksible ‘kloning kassetten”med uttrykk plasmider av hemorroider. Rekombinant fusion proteiner inneholder en svært stabile, monomerisk fluorescerende protein kode ved C-terminalen, som gjør at endepunktet påvisning av enzymet befridde, fluorescerende C-terminalen cleavage produkter utgitt på proteolytisk cleavage ( Figur 1A). Renset fluorescerende intakt substrater løst i ulike buffere brukes også for kalibrering for å vurdere molar konsentrasjonen av underlag og cleavage produkter. Dessuten, etter fluorimetry, kan analysen komponentene analyseres av SDS-side, også. Både native (nondenatured) og denaturert fluorescerende proteiner kan visualiseres i gel, umiddelbart etter geleelektroforese eller senere i-gel renaturation, henholdsvis. Denne ekstra prosedyre i kombinasjon med en konvensjonell Coomassie briljant blå flekker-kan brukes effektivt for verifikasjon av analyseresultatene (figur 1B).
Analyse-prosedyre består av enkle, lett-å-utføre trinnene i et lavt volum-format som kan tilpasses fullstendig til en høy gjennomstrømming automatisk miljø. Men anses uavhengig fra utfører analysen manuelt eller med en automatisering system, følgende deler av analysen avgjørende og trenger spesiell oppmerksomhet mens du utfører prosedyren. i) homogenitet av magnetiske perle løsningen. En homogen magnetiske perle løsning må brukes hele analysen, både i rensing og vaske trinnene. Spesielt avhengig pålitelighet protease analyser sterkt av riktig aliquoting substrat tilknyttet magnetiske perle (SAMB) lager løsninger. For å øke effektiviteten av suspensjon og spredning, anbefales det å sette bead konsentrasjon mellom 2% og 10% (v/v). Under eksempel forberedelse, bruk av buffere supplert med ikke-ionisert vaskemiddel (som Triton X-100 eller mellom 20) opp til 2% kan også redusere overholdelse av magnetiske perler av plast overflater. Overholdelse av perler til veggene av prøven ampuller kan unngås hvis perle suspensjoner brukes nøye på bunnen av ampullene i stedet for onto veggene av prøven rør. Homogenitet av magnetiske perler under enzymatiske reaksjonen er også kritisk og kan sikres av kontinuerlig risting prøvene på 600 rpm under inkubasjon. Perler er skikkelig spredt i avrundet eller flat bunn plast varer, mens bruk av V-bunn ampuller ikke anbefales. En suboptimal resultatet skyldes uriktig perle homogenisering er representert i figur 4B. II) opphør av reaksjon prøver. En annen fordel av metoden er at den enzymatiske reaksjonen kan bli avsluttet uten bruk av varmebehandling rødsprit eller noen potensielt forstyrrende midler15. Avslutningen kan utføres ved å skille de magnetiske perlene fra reaksjonsblandingen, ved hjelp av en konvensjonell magnetiske partikler konsentrator. Mens bufferen som fjernet reaksjon inneholder aktive enzymet og genererte C-terminalen fluorescerende cleavage produktene, forbli uncleaved substrater knyttet til perler. På grunn av tilstedeværelsen av aktiv enzym i reaksjon bufferen må separasjon prosedyren utføres nøye for pålitelig endepunktet gjenkjenning. Før du plasserer eksempel ampullene i presisjonstørking, anbefales det å bruke et kort spin sentrifugering. Etter å plassere rør i presisjonstørking, gi minst 15 s perler inn. Svak bevegelse av separatoren frem og tilbake kan lette innsamling av perler. Vurder at, under en manuelt utført separasjon, oppsigelse vanligvis tar mer tid enn initiering av reaksjonene. Derfor anbefales en ca 2 min registrert forsinkelse mellom innvielser hvis inkubasjon samtidig må brukes på alle prøvene.
Prinsippet om beskrevet proteolytisk analysen er relativt enkelt. men er allsidigheten av systemet garantert av fleksibel og stabil substrat strukturen. Individuelle optimalisering av analysen kan være begrenset av kompatibiliteten til affinitet perler med de anvendt, reagenser og tilsetningsstoffer. Med produsentens protokollen fant vi også at affinitet binding av underlag til Ni-NTA perle overflaten vesentlig svekker på pH ≤ 6,515. Derfor er det anbefalt å bruke substrat tom prøver parallelt reaksjon prøvene, og frekvensen av spontane substrat dissosiasjon må vurderes under evaluering av resultatene.
I de tilfellene hvor magnetisk-perle-baserte analyser ikke kan utføres på grunn av bruk av perle-kompatibel komponenter eller en lav pH, kan i-løsning fordøyelsen av renset rekombinant substrater også brukes. I disse tilfellene reaksjon blandinger kan bli analysert ved geleelektroforese og proteiner kan visualiseres i gel basert på beskrevet protokollen. Undersøke proteolytiske, kan i-løsning fordøyelsen og i-gel påvisning av proteiner også være alternative verktøy av fluorimetry. En nyhet av designet underlaget er anvendelsen av en i-gel renaturation trinn etter denaturing SDS-side. Mens opprinnelig (nondenatured) fluorescerende proteiner beholde sine fluorescens under geleelektroforese, er egenskapen fluorescerende avskaffet på rødsprit (figur 7B). Imidlertid kan fluorescens denaturert proteiner delvis utvinnes av fjerningen av SDS fra gel. Dermed muliggjør en separasjon av reaksjon komponenter denaturing betingelser ikke bare den fluorescens-baserte men molekylær-vekt-baserte identifikasjon. En annen fordel med fluorescerende i-gel deteksjon forhold til analyse av en Coomassie-farget gel er at (opprinnelig eller rehabilitert) fluorescerende proteinene kan lett identifiseres i gel basert på deres fluorescens (se figur 7). Dette kan være viktig hvis cleavage reaksjoner utføres i prøver som inneholder nonfluorescent forurensninger eller proteiner svært ligner molekylvekt av hverandre.
Protease analyser med tilsvarende designet underlag er allerede publisert tidligere8,9,10, og selv om cleavage stedet av interesse i disse tilfellene var også plassert mellom en affinitet-kode og fluorescerende protein, analysen systemet presentert her ikke bare gjentar beskrevet ideer men kombinerer de forskjellige fordelene de tidligere plattformene og også fullføres dem med ytterligere forbedringer: i) bruken av en MBP fusion partner, ii) det tilstedeværelsen av en TEV PR kontroll cleavage nettsted, iii) bruk av nylig foretatt monomerisk FPs og iv) anvendelsen av en unik substrat kalibreringsprosedyren. Analysen selv var spesielt designet for å være nyttig for enzym spesifisitet og kinetisk studier i et trygt, tid – og kostnadseffektiv måte, uten behov for dyre instrumentering. Metoden er rettet til å være egnet og rimelig verktøy for både industri og akademisk forskningsformål. På grunn av fleksibiliteten til ‘kloning kassetten’ av uttrykket plasmider, kan systemet være egnet for rask og rimelig generasjon av rekombinant substrat biblioteker. Her beskrives analysen er en mulig verktøy for gjennomføring av underlaget spesifisitet, enzymet mutagenese, og hemming studier, og også gi et verktøy for å utføre enzym kinetics. Analysen plattform (bakteriell celle avbrudd til fastsettelse av parameterne kinetic) kan tilpasses en HTS – og automatisering-basert miljø og, muligens kan brukes i industrielle protease hemmer screening og/eller antiviral stoffet utvikling. I tillegg er tilpasningen av analysen for konkurrerende proteolyse også i fremtiden omfanget av vårt laboratorium. I slike en konkurransedyktig analysen, to forskjellige underlag-hver som inneholder en annen cleavage område smeltet en annen C-terminalen fluorescerende tag-er brukes samtidig i samme cleavage reaksjon for å undersøke preferanse for de studerte enzymet for gitt mål sekvensene. Videre er bruk av en 96-brønns plate-tilpasset analysen form (Figur 8) også å være optimalisert for mutasjon screening ved hjelp av en rekke underlag med endrede cleavage området sekvenser ved cystein proteaser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet var støttes delvis av GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “PHARMPROT sammen” prosjekt og også finansiert av høyere utdanning institusjonelle Excellence studiet av departementet for Human kapasiteter i Ungarn, innenfor rammen av den Bioteknologi tematiske programmet for universitetet av Debrecen. Forfatterne er takknemlig for medlemmer av laboratoriet av Retroviral biokjemi for sine vitenskapelige hjelp under analysen utvikling og også for deres tålmodighet under filmingen analysen (spesielt til Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz og Vanda Toldi, som vises i bakgrunnen av videoen). Forfatterne vil også si spesiell takk til Gedeon Richter Plc., spesielt til Dr. Zoltán Urbányi for å la Beáta Bozóki arbeid i avdeling for biokjemi og molekylærbiologi som gjest forsker. Forfatterne også gjerne utvide sin takknemlighet György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi og Zoltán Király fra Multimedia og E-læring teknisk midten av universitetet av Debrecen for profesjonell hjelp i lyd og video produksjon.
10K Amicon tubes | Merck-Millipore | UFC501096 | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | M6250 | |
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid | Merck | 100063 | |
Agarose | SERVA | 11404.04 | |
Alpha Imager HP gel documentation system | ProteinSimple | ||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A3678 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A9518 | |
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge | Beckman Coulter | 392185 | |
Black half-area plates | Greiner bio-One | 675086 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | B0126 | |
CutSmart buffer (10x) | New England Biolabs | B7204S | For plasmid linearization (step 1.1.1) |
Dark Reader transilluminator | Clare Chemical Research | DR-45M | |
DNase I | New England Biolabs | M0303L | |
Dynamag-2 magnetic particle concentrator | Thermo Fischer Scientific | 12321D | |
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | C600003 | |
Ethanol | Merc-Millipore | 100983 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 798681 | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycerol | Merck | 356350 | |
Glycine | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | G7126 | |
High-Speed Plasmid Mini Kit | GeneAid | PD300 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 56750 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | AM9464 | |
Jouan CR 412 centrifuge | Jouan | CR412 | |
Labinco LD-76 Rotator | Labinco | 7600 | |
Luria-Bertani (LB) broth | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L3022 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L6876 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
MERCK eurolab ultrasonic bath | MERCK | USR54H | |
Millifuge Eppendorf spin centrifuge | Millipore | CT10 | |
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell | Bio-Rad | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T9281 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific | ||
NheI-HF restriction endonuclease | New England Biolabs | R3131L | |
Nickel(II) sulfate (NiSO4) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 656895 | |
Ni-NTA magnetic agarose beads | Qiagen | 36113 | |
Orbital shaker | Biosan | OS-20 | |
PacI restriction endonuclease | New England Biolabs | R0547L | |
PageBlue Protein Staining Solution | Thermo Fischer Scientific | 24620 | |
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P7626 | |
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes | Eppendorf | 22431102 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
Snijders Press-to-Mix shaker | Gemini | 34524 | |
Sodium-acetate trihydrate | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S7670 | |
Sodium-chloride | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S9888 | |
Sodium-hydroxide | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S5881 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fischer Scientific | S7563 | |
T4 DNA ligase | Promega | M180A | |
Thermo shaker | Biosan | TS-100 | with SC-24 accessory block |
Tris | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T1503 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P2287 | |
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter | Wallac Oy, Turku, Finland |