यहां, हम एक हाल ही में विकसित छेड़ने परख मंच का उपयोग एन-टर्मिनल hexahistidine/माल्टोज़-बाध्यकारी प्रोटीन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की विस्तृत प्रक्रिया मौजूद-रिकॉमबिनेंट निकल की सतह से जुड़ी सब्सट्रेट-nitrilotriacetic एसिड चुंबकीय agarose मोती । सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा अलग परख नमूनों का बाद में जेल विश्लेषण भी प्रस्तुत किया गया है ।
रोगजनन में रहने वाले जीवों के कई जैविक रास्ते में उनकी आवश्यक भूमिकाओं के कारण एंजाइमों का गहन अध्ययन किया जाता है; इसलिए, वे महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य कर रहे हैं । हम proteolytic गतिविधि है, जो रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट के उपयोग पर आधारित है की जांच के लिए एक चुंबकीय agarose-मनका आधारित परख मंच विकसित किया है । आदेश में इस परख प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, एक प्रोटोकॉल मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) को छेड़ने के उदाहरण पर प्रस्तुत किया है । शुरू परख मंच कुशलतापूर्वक mutagenesis, काइनेटिक, निषेध, या विशिष्टता अध्ययन में एंजाइम गतिविधि माप सहित, के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन में उपयोग किया जा सकता है, और यह उच्च प्रवाह के लिए उपयुक्त हो सकता है सब्सट्रेट स्क्रीनिंग या अन्य proteolytic एंजाइमों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस परख प्रणाली में, एप्लाइड सब्सट्रेट एन टर्मिनल hexahistidine (अपने6) और माल्टोज़-बाध्यकारी प्रोटीन (MBP) टैग, तंबाकू खोदना वायरस (टेव) और एचआईवी-1 के लिए दरार साइटों, और एक सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं । सब्सट्रेट कुशलतापूर्वक ई कोलाई कोशिकाओं में उत्पादित किया जा सकता है और आसानी से निकल (Ni) का उपयोग कर शुद्ध-chelate-लेपित मोती. परख के दौरान, मनका के proteolytic दरार-संलग्न सब्सट्रेट फ्लोरोसेंट दरार टुकड़े, जो fluorimetry द्वारा मापा जा सकता है की रिहाई की ओर जाता है । इसके अतिरिक्त, क्लीवेज प्रतिक्रियाओं सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । में जेल renaturation परख घटकों के लिए एक प्रोटोकॉल भी वर्णित है, के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आंशिक renaturation उनके आणविक वजन और प्रतिदीप्ति के आधार पर पता लगाने में सक्षम बनाता है ।
Proteolytic एंजाइमों चयापचय रास्ते में और औद्योगिक अनुप्रयोगों में उनके महत्व के कारण सबसे अधिक गहन जांच की एंजाइम समूहों के हैं, के रूप में अच्छी तरह से । वायरल रोगों में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका, रक्त के थक्के, कैंसर, और हृदय और neurodegenerative रोगों के विनियमन दवा की खोज के क्षेत्र में प्रमुख लक्ष्यों को चिढ़ाती है । इसलिए, सब्सट्रेट विशिष्टता का विस्तृत लक्षण वर्णन और अवरोध करनेवाला (पीआर) के हित की रूपरेखा निर्णायक है और अधिमानतः तेजी से, लागत कुशल द्वारा प्रदर्शन किया, और मजबूत जैव रासायनिक परख1,2, 3.
आजकल, में इन विट्रो की विशाल बहुमत परख की दवा खोज के क्षेत्र में लागू यौगिक रूपरेखा के लिए सजातीय हैं, फ्लोरोसेंट पेप्टाइड आधारित है, और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS)-संगत प्लेटफार्मों4। इसके अलावा, लेबल पेप्टाइड्स केवल पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, लेकिन वे भी चयनित सब्सट्रेट पर एंजाइम काइनेटिक मापदंडों के निर्धारण के लिए महान उपकरण प्रदान करते हैं । अंय मामलों में, जहां सब्सट्रेट के लेबलिंग संभव नहीं है, जुदाई आधारित परख proteolytic प्रतिक्रियाओं के काइनेटिक गुण3का आकलन करने के लिए एक संभव समाधान प्रदान कर सकते हैं ।
आम तौर पर, इन विट्रो को छेड़ने की परख सब्सट्रेट के दो प्रकार के उपयोग पर आधारित हैं: लघु पेप्टाइड्स या पूरे प्रोटीन. उन मामलों में, जहां छोटे पेप्टाइड अनुक्रम की दरार पर्याप्त दरार के लिए, निंनलिखित मानक दृष्टिकोण लागू होते हैं: (i) ऐसे ऑक्सीकरण इंसुलिन बी चेन, (द्वितीय) परीक्षण के रूप में मानक प्रोटीन सब्सट्रेट की जांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सब्सट्रेट्स अंय के लिए, (iii) सिंथेटिक और फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड मिश्रित रसायन विज्ञान, या (iv) आनुवंशिक तरीकों का उपयोग करके बनाई गई पुस्तकालयों स्क्रीनिंग, उदाहरण के लिए, जैविक प्रदर्शन प्रौद्योगिकियों5, 6. पारंपरिक वर्गीकरण के अलावा, अंय उपंयास प्लेटफार्मों सब्सट्रेट पीढ़ी के लिए भी उपलब्ध है (जैसे, proteome के गठन-व्युत्पंन पेप्टाइड पुस्तकालयों7 या आनुवंशिक तरीकों के विशेष उपप्रकार, रिकॉमबिनेंट फ्यूजन की तरह प्रोटीन आधारित सब्सट्रेट8,9,10,11,12).
उपर्युक्त सब्सट्रेट प्रकार और परख के सभी अपने फायदे और सीमाएं हैं, और परख स्वरूपों के विकास के संयोजन और/या ज्ञात प्लेटफार्मों के लाभ में सुधार अभी भी मांग में है । यहां हम एक जुदाई के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-फ्लोरोसेंट चिढ़ा परख, जो रिकॉमबिनेंट सब्सट्रेट इस्तेमाल आधारित है । ये फ्यूजन प्रोटीन अपने6 और MBP टैग से मिलकर बनता है टेव पीआर है, जो ब्याज की सब्सट्रेट अनुक्रम है कि सीधे एक सी टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) से जुड़ा है के द्वारा पीछा किया जाता है की एक नियंत्रण दरार साइट (एफ 1) (चित्र 1a) । एक डीएनए ‘ क्लोनिंग कैसेट ‘ में ब्याज की एक दरार साइट के लिए कोडिंग अनुक्रम की क्लोनिंग अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, जो पहले प्रतिबंध endonucleases द्वारा रैखिक किया गया है में एक ही बंधाव प्रतिक्रिया द्वारा किया जा सकता है ।
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट चिढ़ाने की परख के सिद्धांत । (एक) मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) के द्वारा एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट और अपनी दरार का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाया गया है । तीर के भीतर दरार की स्थिति को इंगित करता है मैट्रिक्स/कैप्सिड दरार साइट एचआईवी के अनुक्रम-1 चिढ़ाना (VSQNY * PIVQ) । (ख) फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट को नी-ंत् चुंबकीय-मनका-आधारित परख और polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा एंजाइम प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से, के रूप में कार्यप्रवाह आरेख में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
हालांकि proteolytic परख समान रिकॉमबिनेंट प्रोटीन सब्सट्रेट का उपयोग कर-एक संबध टैग, एक proteolytic दरार साइट युक्त, और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन-पहले से ही8,9,10, प्रणाली वर्णित किया गया है यहां प्रस्तुत करने के लिए एकीकृत और इन तरीकों के लाभों पर सुधार करना चाहता है । एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि इस परख मंच में फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट MBP से सुसज्जित करने के लिए प्रोटीन घुलनशीलता13 बढ़ाने और टेव पीआरएस के लिए एक नियंत्रण दरार साइट शामिल हैं । इसके अलावा, सब्सट्रेट नई पीढ़ी फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं, जो अत्यधिक स्थिर हैं और सब्सट्रेट एकत्रीकरण को रोकने के लिए एक monomeric रूप है । mTurquoise2 के पहले प्रकाशित आवेदन के अलावा-और mApple-जुड़े रूपों14, यहां हम भी एक रिकॉमबिनेंट एक monomeric बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mEYFP) फ्लोरोसेंट टैग युक्त सब्सट्रेट के उपयोग द्वारा दिए गए परिणाम दिखा । इसके द्वारा हम अंय फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्रणाली की अनुकूलता का प्रदर्शन और परिणाम है कि चिढ़ाने परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है की कुछ सामांय प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं और एक निकल-nitrilotriacetic एसिड (Ni-ंत्) लेपित चुंबकीय-agarose-मनका-संलग्न रूप में परख के लिए सब्सट्रेट्स के रूप में उपयोग किया जाता है । सी-टर्मिनल दरार उत्पादों के लिए ब्याज की चिढ़ा द्वारा दरार पर supernatant में मनका सतह से मुक्त कर रहे हैं । supernatant की जुदाई के बाद (एंजाइम और क्लीवेज उत्पादों से युक्त) चुंबकीय मोतियों से, प्रतिदीप्ति एंजाइम के क्लीवेज गुण निर्धारित करने के लिए मापा जा सकता है. पहले वर्णित विधियों के विपरीत, यहां प्रस्तुत प्रणाली में, सब्सट्रेट और सी टर्मिनल दरार उत्पादों की मात्रा विशिष्ट quantified एक विस्तृत सब्सट्रेट अंशांकन प्रक्रिया पर आधारित हैं । परख प्रणाली एक एसडीएस द्वारा समर्थित किया जा सकता है-परख नमूनों के पृष्ठ विश्लेषण; एक बाद में फ्लोरोसेंट जेल दृश्य ट्रो के बाद या nondenatured और विकृत फ्लोरोसेंट घटकों, क्रमशः14के जेल renaturation के बाद तुरंत लागू किया जा सकता है ।
लचीलापन और ‘ क्लोनिंग ‘ कैसेट की संरचना एक समय की अनुमति और लागत निर्माण में दृश्यों की एक विस्तृत विविधता के कुशल सम्मिलन और, इस प्रकार, सब्सट्रेट पुस्तकालयों की पीढ़ी को बढ़ावा देता है. के बाद से सभी परख कदम स्वचालन और HTS-संगत कर रहे हैं, प्रणाली के लिए विशेष रूप से आकर्षक हो सकता है, उदाहरण के लिए, विशिष्टता माप और mutagenesis अध्ययन, या यह भी प्रभावी रूप से औद्योगिक छेड़ने अवरोधक स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है और/या एंटीवायरल दवा विकास, के रूप में अच्छी तरह से ।
एंजाइम काइनेटिक मापदंडों (कश्मीरकैट, कश्मीरएम) विकसित जुदाई आधारित परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है; इसलिए, यह इस तरह के समय के रूप में व्यक्तिगत एंजाइम काइनेटिक माप, प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है, सब्सट्रेट-निर्भर, और निषेध अध्ययन. यह साबित होता है कि रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट अक्सर उपयोग सिंथेटिक oligopeptide सब्सट्रेट के लिए अच्छा विकल्प प्रदान करते हैं, और polyprotein सब्सट्रेट करने के लिए अपने उच्च समानता के कारण, वे स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रतिनिधित्व एंजाइम सब्सट्रेट अधिक सही बातचीत.
कारण proteolytic एंजाइमों के गहन औद्योगिक और अकादमिक जांच और शीघ्र और सस्ती HTS के लिए लगातार मांग-संगत परख प्लेटफार्मों तदनुसार, हम एक चुंबकीय-मनका आधारित फ्लोरोसेंट छेड़ने का विकास किया है परख. परख रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन जो व्यापक रूप से उपयोग सिंथेटिक पेप्टाइड सब्सट्रेट करने के लिए उपंयास विकल्प हो सकता है के उपयोग पर आधारित है ।
विकसित परख प्रारूप में, फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट नी-chelate-लेपित चुंबकीय agarose मोतियों की सतहों को मैटीरियल कर रहे हैं । सब्सट्रेट लगाव एन-टर्मिनल अपने फ्यूजन प्रोटीन है, जो सीधे एक MBP टैग से जुड़े के क्रम में तह की सुविधा के लिए और सब्सट्रेट13के पानी घुलनशीलता बढ़ाने के लिए है की6 संबध टैग द्वारा प्रदान की जाती है । MBP टेव पीआर और ब्याज की एक को छेड़ने की दरार साइटों द्वारा पीछा किया जाता है । पूर्व परख में एक नियंत्रण दरार साइट के रूप में सेवा कर सकते हैं, जबकि उत्तरार्द्ध द्वारा संसाधित किया जा सकता है की जांच की जानी चाहिए । दरार साइट विनिमेय है; एक लघु dsDNA अनुक्रम ब्याज की दरार साइट के लिए कोडिंग ‘ लचीले बंधाव द्वारा प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की ‘ क्लोनिंग कैसेट में डाला जा सकता है । रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन एक अत्यधिक स्थिर, सी में monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग-टर्मिनल, जो एंजाइम के समापन बिंदु का पता लगाने में सक्षम बनाता है मुक्त, फ्लोरोसेंट सी-टर्मिनल दरार उत्पादों proteolytic दरार पर जारी ( चित्र 1a) । शुद्ध फ्लोरोसेंट बरकरार सब्सट्रेट अलग बफ़र्स में हल भी सब्सट्रेट और दरार उत्पादों की दाढ़ सांद्रता का आकलन करने के लिए अंशांकन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इसके अलावा, fluorimetry के बाद, परख घटकों एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है पृष्ठ, के रूप में अच्छी तरह से । दोनों देशी (nondenatured) और विकृत फ्लोरोसेंट प्रोटीन जेल में visualized किया जा सकता है, तुरंत ट्रो के बाद या बाद में जेल renaturation, क्रमशः के बाद । इस अतिरिक्त प्रक्रिया-संयोजन में एक पारंपरिक Coomassie शानदार नीले दाग के साथ-परख परिणाम (आंकड़ा 1b) के सत्यापन के लिए कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
परख प्रक्रिया सरल, आसान करने के लिए एक कम मात्रा प्रारूप है कि पूरी तरह से एक उच्च प्रवाह स्वचालित वातावरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है में कदम निष्पादित होते हैं । हालांकि, स्वतंत्र रूप से या तो स्वयं या एक स्वचालन प्रणाली के साथ परख प्रदर्शन से, परख के निंनलिखित भागों में महत्वपूर्ण माना जाता है और विशेष ध्यान देने की जरूरत है, जबकि प्रक्रिया प्रदर्शन । i) चुंबकीय मनका समाधान की एकरूपता । एक सजातीय चुंबकीय मनका समाधान परख भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, दोनों शुद्धि और धुलाई चरणों में । विशेष रूप से, जोरदार परख की विश्वसनीयता दृढ़ता से aliquoting सब्सट्रेट-संलग्न चुंबकीय मनका (SAMB) स्टॉक समाधान पर निर्भर करता है । आदेश में निलंबन और फैलाव की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए, यह 2% और 10% के बीच मनका एकाग्रता सेट करने के लिए सिफारिश की है (v/ नमूना तैयारी के दौरान, (जैसे ट्राइटन एक्स-१०० या 20 के बीच) 2% तक भी प्लास्टिक सतहों के लिए चुंबकीय मोतियों के पालन में कमी हो सकती है के रूप में गैर ईओण डिटर्जेंट के साथ पूरक बफ़र्स का उपयोग करें । मोतियों का नमूना शीशियों की दीवारों के पालन से बचा जा सकता है अगर मनका निलंबन ध्यान से शीशियों के बजाय नमूना ट्यूबों की दीवारों पर की तह तक लागू कर रहे हैं । एंजाइमी प्रतिक्रिया के दौरान चुंबकीय मोतियों की एकरूपता भी महत्वपूर्ण है और लगातार मशीन के दौरान ६०० rpm पर नमूने मिलाते द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है । मनका ठीक से गोल या फ्लैट तली हुई प्लास्टिक के माल में फैला रहे हैं, जबकि वी नीचे शीशियों के उपयोग की सिफारिश नहीं है । अनुचित मनका homogenization की वजह से एक इष्टतम परिणाम चित्रा 4Bमें प्रतिनिधित्व किया है । ii) प्रतिक्रिया नमूनों की समाप्ति. विधि का एक अंय लाभ यह है कि एंजाइमी प्रतिक्रिया गर्मी विकार उपचार या किसी भी संभावित हस्तक्षेप रासायनिक एजेंटों15के उपयोग के बिना समाप्त किया जा सकता है । समाप्ति बस प्रतिक्रिया मिश्रण से चुंबकीय मोती अलग करके किया जा सकता है, एक पारंपरिक चुंबकीय कण केंद्रित का उपयोग कर । हालांकि हटा प्रतिक्रिया बफर सक्रिय एंजाइम और उत्पन्न सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट दरार उत्पादों, uncleav सब्सट्रेट मोतियों से जुड़ी रहती हैं । प्रतिक्रिया बफ़र में सक्रिय एंजाइम की उपस्थिति के कारण, पृथक्करण प्रक्रिया विश्वसनीय समापन बिंदु का पता लगाने के लिए सावधानीपूर्वक किया जा करने के लिए की आवश्यकता है । ध्यानी में नमूना शीशियों रखने से पहले, यह एक छोटी स्पिन केंद्रापसारक लागू करने के लिए सिफारिश की है. के बाद ध्यानी में ट्यूबों रखने के लिए, मोती एकत्र करने के लिए कम से 15 एस प्रदान करते हैं । विभाजक के थोड़ा आंदोलन वापस और आगे मोतियों के संग्रह की सुविधा हो सकती है । कृपया विचार है कि, एक मैंयुअल रूप से प्रदर्शन जुदाई के दौरान, समाप्ति आमतौर पर प्रतिक्रियाओं की दीक्षा से अधिक समय लगता है । इसलिए, एक लगभग 2 मिनट पंजीकृत देरी दीक्षा के बीच की सिफारिश की है अगर एक ही मशीन समय सभी नमूनों को लागू करने की जरूरत है ।
वर्णित proteolytic परख का सिद्धांत अपेक्षाकृत सरल है; हालांकि, प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा लचीला और स्थिर सब्सट्रेट संरचना द्वारा की गारंटी है । परख के व्यक्तिगत अनुकूलन केवल लागू की गई शर्तों, रिएजेंट, और additives के साथ संबंध मोतियों की अनुकूलता के द्वारा सीमित किया जा सकता है । निर्माता के प्रोटोकॉल के साथ समझौते में, हम यह भी पाया कि Ni-ंत् मनका सतहों के संबध बाध्यकारी काफी पीएच ≤ ६.५15में कमजोर । इसलिए, यह प्रतिक्रिया के नमूनों के समानांतर सब्सट्रेट रिक्त नमूनों को लागू करने के लिए सिफारिश की है, और सहज सब्सट्रेट पृथक्करण की दर परिणामों के मूल्यांकन के दौरान विचार किया जा करने की जरूरत है.
उन मामलों में, जहां चुंबकीय-मनका आधारित परख मनका के उपयोग के कारण नहीं किया जा सकता-असंगत घटकों या एक कम पीएच, में-शुद्ध रिकॉमबिनेंट सब्सट्रेट के समाधान पाचन भी लागू किया जा सकता है । इन मामलों में, प्रतिक्रिया मिश्रण ट्रो द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, और प्रोटीन वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर जेल में visualized किया जा सकता है । proteolytic गतिविधि की जांच करने के लिए, में समाधान पाचन और जेल में प्रोटीन का पता लगाने भी fluorimetry के वैकल्पिक उपकरण हो सकता है । डिजाइन सब्सट्रेट प्रणाली की एक नवीनता denaturing एसडीएस-पृष्ठ के बाद जेल renaturation कदम के आवेदन पत्र है । जबकि देशी (nondenatured) फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रो के दौरान अपने प्रतिदीप्ति को बनाए रखने, फ्लोरोसेंट संपत्ति विकार (चित्रा 7B) पर समाप्त कर दिया है । तथापि, विविकृत प्रोटीनों के प्रतिदीप्ति को जेल से एसडीएस के निष्कासन से आंशिक रूप से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार, प्रतिक्रिया घटकों का एक जुदाई denaturing शर्तों का उपयोग न केवल प्रतिदीप्ति आधारित है, लेकिन आणविक वजन आधारित पहचान संभव बनाता है । एक Coomassie-दाग जेल के विश्लेषण की तुलना में फ्लोरोसेंट में जेल का पता लगाने का एक और लाभ यह है कि (देशी या renature) फ्लोरोसेंट प्रोटीन आसानी से अपने प्रतिदीप्ति के आधार पर जेल में पहचाना जा सकता है ( चित्रा 7देखें) । यह महत्वपूर्ण हो सकता है अगर दरार प्रतिक्रियाओं में फ्लोरोसेंट दूषित पदार्थों या प्रोटीन अत्यधिक एक दूसरे के आणविक भार जैसी युक्त नमूनों में प्रदर्शन कर रहे हैं ।
इसी तरह डिजाइन किए गए सब्सट्रेट का उपयोग कर परख पहले से ही पहले8,9,10प्रकाशित किया गया है, और हालांकि उन मामलों में ब्याज की दरार साइट भी एक संबंध टैग और एक के बीच स्थित था फ्लोरोसेंट प्रोटीन, परख प्रणाली यहां प्रस्तुत न केवल वर्णित विचारों को दोहराता है, लेकिन पिछले प्लेटफार्मों के विभिंन लाभों को जोड़ती है और भी उंहें आगे सुधार के साथ पूरा: i) एक MBP फ्यूजन साथी, द्वितीय के उपयोग) एक टेव पीआर नियंत्रण दरार साइट की उपस्थिति, iii) के नए इंजीनियर monomeric एफपीएस का उपयोग करें, और iv) एक अद्वितीय सब्सट्रेट अंशांकन प्रक्रिया के आवेदन. परख ही विशेष रूप से एक सुरक्षित, समय में एंजाइम विशिष्टता और काइनेटिक अध्ययन के लिए उपयोगी हो डिजाइन किया गया था और लागत कुशल तरीके से, महंगी उपकरण की आवश्यकता के बिना । विधि के लिए एक उपयुक्त और सस्ती दोनों औद्योगिक और अकादमिक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपकरण का उद्देश्य है । अभिव्यक्ति प्लाज्मिड की ‘ क्लोनिंग कैसेट ‘ के लचीलेपन के कारण यह प्रणाली रिकॉमबिनेंट सब्सट्रेट पुस्तकालयों की तेज और सस्ती पीढ़ी के लिए उपयुक्त हो सकती है. इस के साथ साथ वर्णित परख सब्सट्रेट विशिष्टता, एंजाइम mutagenesis, और निषेध अध्ययन के कार्यांवयन के लिए एक व्यवहार्य उपकरण है और, यह भी, एक वैकल्पिक उपकरण प्रदान करने के लिए एंजाइम कैनेटीक्स प्रदर्शन । परख मंच (बैक्टीरियल कोशिका विघटन से काइनेटिक मापदंडों के निर्धारण के लिए) एक HTS के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और स्वचालन आधारित पर्यावरण और, संभवतः, औद्योगिक छेड़ने अवरोधक स्क्रीनिंग और/या एंटीवायरल दवा में लागू किया जा सकता है विकास. इसके अतिरिक्त, प्रतिस्पर्धी प्रोटियोलिसिस के लिए परख का अनुकूलन भी हमारी प्रयोगशाला के भविष्य के दायरे में है । इस तरह के एक प्रतियोगी परख, दो अलग सब्सट्रेट-एक अलग दरार एक अलग सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग करने के लिए जुड़े साइट से युक्त प्रत्येक-एक ही दरार प्रतिक्रिया में अध्ययन के वरीयता की जांच करने के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा करने का इरादा कर रहे है दिए गए लक्ष्य दृश्यों के लिए एंजाइम । इसके अलावा, एक ९६ के उपयोग के अच्छी तरह से थाली-परख फार्म (8 अंक) अनुकूलित भी उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग के लिए संशोधित cysteine के मामले में दरार साइट दृश्यों के साथ सब्सट्रेट की एक श्रृंखला का उपयोग करके अनुकूलित किया जा रहा है ।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “PHARMPROT teaming” परियोजना द्वारा भाग में समर्थित किया गया था और यह भी, हंगरी में मानव क्षमताओं के मंत्रालय के उच्च शिक्षा संस्थागत उत्कृष्टता कार्यक्रम द्वारा वित्तपोषित, के ढांचे के भीतर जैव प्रौद्योगिकी Debrecen विश्वविद्यालय के विषयगत कार्यक्रम । लेखक परख विकास के दौरान उनकी वैज्ञानिक मदद के लिए Retroviral जैव रसायन की प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए आभारी है और भी परख फिल्माने के दौरान उनके धैर्य के लिए (विशेष रूप से Norbert Kassay, क्रिस्टीना Joóné Matúz, और Vanda Toldi, जो वीडियो की पृष्ठभूमि में दिखाई दे रहे हैं) । लेखक भी Gedeon रिक्टर पीएलसी के लिए विशेष धन्यवाद कहना चाहूंगा., विशेष रूप से जैव रसायन विभाग में Beáta Bozóki’s काम की अनुमति देने के लिए डॉ Zoltán Urbányi के लिए और एक अतिथि शोधकर्ता के रूप में आण्विक जीव विज्ञान । लेखक भी ऑडियो और वीडियो में व्यावसायिक सहायता के लिए Balázs विश्वविद्यालय के मल्टीमीडिया और ई-लर्निंग तकनीकी केंद्र से György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Pöstényi Zoltán, और Király Debrecen के लिए उनके आभार का विस्तार करना चाहेंगे उत्पादन.
10K Amicon tubes | Merck-Millipore | UFC501096 | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | M6250 | |
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid | Merck | 100063 | |
Agarose | SERVA | 11404.04 | |
Alpha Imager HP gel documentation system | ProteinSimple | ||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A3678 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A9518 | |
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge | Beckman Coulter | 392185 | |
Black half-area plates | Greiner bio-One | 675086 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | B0126 | |
CutSmart buffer (10x) | New England Biolabs | B7204S | For plasmid linearization (step 1.1.1) |
Dark Reader transilluminator | Clare Chemical Research | DR-45M | |
DNase I | New England Biolabs | M0303L | |
Dynamag-2 magnetic particle concentrator | Thermo Fischer Scientific | 12321D | |
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | C600003 | |
Ethanol | Merc-Millipore | 100983 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 798681 | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycerol | Merck | 356350 | |
Glycine | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | G7126 | |
High-Speed Plasmid Mini Kit | GeneAid | PD300 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 56750 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | AM9464 | |
Jouan CR 412 centrifuge | Jouan | CR412 | |
Labinco LD-76 Rotator | Labinco | 7600 | |
Luria-Bertani (LB) broth | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L3022 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L6876 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
MERCK eurolab ultrasonic bath | MERCK | USR54H | |
Millifuge Eppendorf spin centrifuge | Millipore | CT10 | |
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell | Bio-Rad | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T9281 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific | ||
NheI-HF restriction endonuclease | New England Biolabs | R3131L | |
Nickel(II) sulfate (NiSO4) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 656895 | |
Ni-NTA magnetic agarose beads | Qiagen | 36113 | |
Orbital shaker | Biosan | OS-20 | |
PacI restriction endonuclease | New England Biolabs | R0547L | |
PageBlue Protein Staining Solution | Thermo Fischer Scientific | 24620 | |
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P7626 | |
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes | Eppendorf | 22431102 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
Snijders Press-to-Mix shaker | Gemini | 34524 | |
Sodium-acetate trihydrate | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S7670 | |
Sodium-chloride | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S9888 | |
Sodium-hydroxide | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S5881 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fischer Scientific | S7563 | |
T4 DNA ligase | Promega | M180A | |
Thermo shaker | Biosan | TS-100 | with SC-24 accessory block |
Tris | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T1503 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P2287 | |
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter | Wallac Oy, Turku, Finland |