Vi præsenterer her, en detaljeret procedure for en nyligt udviklede protease assay platform udnytter N-terminale hexahistidine/maltose-bindende protein og fluorescerende proteiner-smeltet rekombinant substrater knyttet til overfladen af nikkel-nitrilotrieddikesyre syre magnetiske Agarosen perler. En efterfølgende i-gel analyse af assay prøverne adskilt af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese er også præsenteret.
Proteaser er intensivt undersøgt enzymer på grund af deres væsentlige roller i flere biologiske veje af levende organismer og i patogenesen; Derfor er de vigtige stof mål. Vi har udviklet en magnetisk-Agarosen-perle-baserede assay platform for undersøgelse af proteolytiske aktivitet, som er baseret på brugen af rekombinant fusion protein substrater. For at demonstrere brugen af denne analyse system, præsenteres en protokol på eksemplet med human immundefekt virustype 1 (HIV-1) protease. Den indførte assay platform kan udnyttes effektivt i den biokemiske karakterisering af proteaser, herunder enzym aktivitet målinger i mutagenese, kinetic, hæmning eller specificitet undersøgelser, og det kan være egnet til høj overførselshastighed substrat screening eller kan tilpasses til andre Proteolytiske enzymer.
I denne analyse system, anvendt substraterne indeholder N-terminale hexahistidine (hans6) og maltose-bindende protein (MBPS) tags, kavalergang websteder for tobak etch virus (TEV) og HIV-1 proteaser og en C-terminale fluorescerende proteiner. Substraterne kan fremstilles effektivt i Escherichia coli celler og uden sammenligning renset ved hjælp af nikkel (Ni) – Chelat – belagte perler. Under analysen fører proteolytiske kløvningen af perle-attached substrater til frigivelse af fluorescerende kavalergang fragmenter, der kan måles af fluorimetry. Derudover kan kavalergang reaktioner analyseres af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). En protokol til i-gel genopretning af assay komponenter er også beskrevet, som delvis genopretning af fluorescerende proteiner giver deres påvisning baseret på Molekylær vægt og fluorescens.
Proteolytiske enzymer, der hører til de mest intensivt undersøgte enzym grupper på grund af deres betydning i stofskifteveje og industrielle applikationer. Deres centrale rolle i virussygdomme, regulering af blodpropper, cancer, og hjerte-kar- og neurodegenerative sygdomme gør proteaser fremtrædende mål inden for drug discovery. Derfor, en detaljeret karakterisering af substrat specificitet og hæmmer profilering af protease (PR) af interesse er afgørende og er fortrinsvis udført af hurtig, omkostningseffektiv og robust biokemiske assays1,2, 3.
I dag er størstedelen af in vitro-protease assays anvendes inden for drug discovery for sammensatte profilering er homogen, fluorescerende peptid-baseret, og høj overførselshastighed screening (HTS)-kompatibel platforme4. Derudover mærket peptider er ikke kun egnet til biblioteket screening, men de tilbyder også fantastiske værktøjer til bestemmelse af enzymet kinetiske parametre på de valgte substrater. I andre tilfælde, hvor mærkning af substratet ikke er muligt, kan adskillelse-baserede assays give en mulig løsning for at vurdere de kinetiske egenskaber af proteolytiske reaktioner3.
Generelt, in vitro-protease assays er baseret på brug af to typer af underlag: kort peptider eller hele proteiner. I de tilfælde, hvor kløvningen af korte peptid sekvenser afspejler egenskaberne kavalergang tilstrækkeligt, følgende standard metoder er gældende: (i) undersøge standard protein substrater såsom oxideret insulin B-kæden, (ii) test kommercielt tilgængelige substrater af andre proteaser, (iii) screening syntetiske og fluorescently mærket peptid biblioteker lavet af kombinatorisk kemi, eller (iv) bruge genetiske metoder, for eksempel, biologiske vise teknologier5, 6. Udover de konventionelle klassificering, andre roman platforme er også tilgængelige for substrat generation (f.eks. dannelse af proteomet-afledte peptid biblioteker7 eller særlige undertyper af genetiske metoder, som den rekombinante fusion protein-baserede substrater8,9,10,11,12).
Alle de ovennævnte substrat typer og assays har deres egne fordele og begrænsninger, og udviklingen af assay formater ved at kombinere og/eller forbedre fordelene af de kendte platforme er stadig i efterspørgslen. Her beskriver vi en protokol for en adskillelse-baserede fluorescerende protease assay, der udnytter rekombinant substrater. Disse fusion proteiner består af hans6 og MBP tags smeltet til en kontrol kavalergang site af TEV PR, som efterfølges af substrat sekvens af interesse, som er direkte forbundet til en C-terminale fluorescerende proteiner (FP) (figur 1A). Kloning af en DNA-sekvens kodning for en spaltning site af interesse i den kloning kassette kan udføres af en enkelt ligatur reaktion i udtryk plasmidet, som tidligere har været linearisering af restriktionsendonukleaser.
Figur 1: Princippet om fluorescerende protease assay. (A) den skematisk fremstilling af en fluorescerende substrat og sin spaltning af human immundefekt virustype 1 (HIV-1) protease er vist. Pilen angiver kavalergang position inden for matrix/kapsid kavalergang site sekvens af HIV-1 protease (VSQNY * PIVQ). (B) fluorescerende substrater kan bruges til at analysere enzym reaktioner ved Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse og polyacrylamid gelelektroforese, så godt, som det fremgår af arbejdsprocesdiagram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Selvom proteolytiske assays ved hjælp af lignende rekombinante protein substrater indeholdende en affinitet tag, et proteolytisk kavalergang websted og en fluorescerende proteiner-have allerede blevet beskrevet8,9,10, systemet præsenteret her agter at integrere og forbedre på fordelene ved disse metoder. En vigtig forskel er, at fusion protein substrater i denne analyse-perron er udstyret med MBP at øge protein opløselighed13 og indeholde en kontrol kavalergang site for TEV PRs. Desuden indeholder substraterne nye generation fluorescerende proteiner, som er meget stabil og har en monomere form at forhindre substrat sammenlægning. Udover den tidligere udgivne anvendelsen af mTurquoise2 – og mApple-smeltet former14viser her vi også resultater givet ved hjælp af en rekombinant substrat, der indeholder en monomere forbedret gul fluorescerende proteiner (mEYFP) fluorescerende tag. Herved vi demonstrere kompatibiliteten af systemet med andre fluorescerende proteiner og repræsentere nogle generelle typer af resultater, der kan erhverves af protease assay.
Rekombinant fusion proteiner er udtrykt i E. coli BL21(DE3) celler og anvendes som bærestof for analysen i en nikkel-nitrilotrieddikesyre syre (Ni-NTA)-belagt magnetisk-Agarosen-perle-attached form. C-terminale spaltningsprodukter er befriet fra perle overfladen i supernatanten ved spaltning af protease af interesse. Efter adskillelse af supernatanten (som indeholder enzymet og spaltningsprodukterne) fra de magnetiske perler, kan fluorescens måles for at bestemme kavalergang egenskaber af enzymet. I modsætning til de tidligere beskrevne metoder, er i systemet præsenteres her, mængder af substrat og C-terminale spaltningsprodukter entydigt kvantificeret baseret på en detaljeret substrat kalibreringsmetode. Analyse system kan støttes af SDS-PAGE analyse af assay prøver; en efterfølgende fluorescerende i-gel visualisering kan anvendes umiddelbart efter elektroforese eller i-gel genopretning af nondenatured og denatureret fluorescerende komponenter, henholdsvis14.
Fleksibilitet og struktur i kloning kassetten giver mulighed for en tid – og cost-effektive indsættelse af en bred vifte af sekvenser i konstruktionen og dermed fremmer generation af substrat biblioteker. Da alle assay trin er automation – og HTS-kompatibel, kan systemet være særligt attraktivt for, for eksempel, kan også blive udnyttet effektivt for industrielle protease inhibitor screening protease specificitet målinger og mutagenese undersøgelser, eller det og/eller antiviralt lægemiddel udvikling, så godt.
Enzym kinetiske parametre (kkat, Kjærm) kan bestemmes af den udviklede adskillelse-baseret analyse; Det kan derfor egnet til at udføre individuelle enzym kinetic målinger, som tid-kursus, substrat-afhængige og hæmning undersøgelser. Dette beviser, at rekombinant fusion protein substrater give gode alternativer til de ofte udnyttet syntetiske oligopeptide substrater, og på grund af deres høje lighed med polyprotein substrater, de repræsenterer de naturligt forekommende enzym-substrat interaktioner mere præcist.
På grund af de intensive industrielle og akademiske undersøgelser af Proteolytiske enzymer og de konstante krav om hurtig og billig HTS-kompatible protease assay platforme i overensstemmelse hermed, har vi udviklet en magnetisk-perle-baserede fluorescerende protease assay. Analysen er baseret på brugen af rekombinant fusion proteiner, som kan være nye alternativer til almindeligt udnyttede syntetiske peptid substrater.
I formatet udviklede assay er fusion protein substrater immobiliseret på overflader af Ni-Chelat-belagt magnetiske Agarosen perler. Substrat udlæg er fastsat af N-terminalen hans6 affinitet tag fusion protein, som er direkte smeltet til en MBP tag for at lette den foldning og øge vandopløseligheden af substrat13. MBP er efterfulgt af kavalergang lokaliteter af TEV PR og en protease af interesse. Den tidligere kan tjene som en kontrol kavalergang site i analysen, mens sidstnævnte kan behandles af protease skal undersøges. Webstedet kavalergang er udskiftelige; en kort dsDNA sekvens kodning for webstedet spaltning af interesse kan indsættes i den fleksible kloning kassette af udtryk plasmid af ligatur. Rekombinant fusion proteiner indeholder en yderst stabil, monomere fluorescerende proteiner tag på C-terminal, som gør det muligt for slutpunkt påvisning af de enzym-befriet, fluorescerende C-terminale spaltningsprodukter frigives ved proteolytiske spaltning ( Figur 1A). De renset fluorescerende intakt substrater løst i forskellige buffere bruges også til kalibrering til at vurdere de molære substrater og spaltningsprodukter. Derudover efter fluorimetry, kan assay komponenter analyseres af SDS-PAGE, så godt. Begge (nondenatured) native og denaturerede fluorescerende proteiner kan visualiseres i gelen, umiddelbart efter elektroforese eller efterfølgende i-gel genopretning, henholdsvis. Denne ekstra procedure-i kombination med en konventionel Coomassie strålende blå farvning-kan anvendes effektivt til kontrol af analyse resultater (figur 1B).
Analyseprocedure består af enkle, let at udføre trinnene i en lav-volumen format, der kan være fuldt ud tilpasset til en høj overførselshastighed automatisk miljø. Dog anses uafhængigt fra at udføre analysen, enten manuelt eller med en automatiseringssystem, følgende dele af analysen for at være af afgørende betydning og har brug for særlig opmærksomhed under udførelsen af proceduren. i) ensartethed af magnetisk bead løsning. En homogen magnetisk bead løsning skal anvendes i hele analysen, både i oprensning og vaske trin. Især, afhænger pålideligheden af protease assays stærkt af korrekt aliquoting stamopløsninger substrat-attached magnetisk bead (SAMB). For at øge effektiviteten af suspension og spredning, anbefales det at indstille perle fusion mellem 2% og 10% (v/v). Under prøveforberedelse, brug af buffere suppleret med nonionisk detergent (såsom Triton X-100 eller Tween 20) op til 2% kan også mindske overholdelsen af de magnetiske perler af plast overflader. Overholdelse af perlerne til væggene i stikprøven hætteglas kan undgås, hvis perle suspensioner anvendes forsigtigt på bunden af hætteglas i stedet for på vægge af prøveglassene. Homogenitet af de magnetiske perler under enzymatisk reaktion er også kritisk og kan sikres ved løbende at ryste prøverne på 600 rpm under inkubation. Perler er korrekt spredt i afrundede eller fladbundede plast bagværk, mens brugen af V-bund hætteglas ikke anbefales. En suboptimal resultat forårsaget af forkert perle homogenisering er repræsenteret i figur 4B. II) ophør af reaktion prøver. En anden fordel ved metoden er at den enzymatiske reaktion kan opsiges uden brug af denaturering varmebehandling eller ethvert potentielt interfererende kemiske agenser15. Opsigelse kan foretages blot ved at adskille de magnetiske perler fra reaktionsmiljøet, ved hjælp af en konventionel magnetiske partikel koncentrator. Mens fjernet reaktion bufferen indeholder det aktive enzym og de genererede C-terminale fluorescerende spaltningsprodukter, forbliver de uncleaved substrater knyttet til perlerne. På grund af tilstedeværelsen af det aktive enzym i reaktion buffer skal adskillelse procedure udføres omhyggeligt for pålidelig slutpunkt påvisning. Før du placerer prøve hætteglas til koncentratoren, anbefales det at anvende et kort spin centrifugering. Efter markedsføring af rør i koncentratoren, give mindst 15 s for perler skal indsamles. Lille bevægelse i den separator og tilbage kan lette indsamlingen af perlerne. Overvej venligst at under en manuelt udførte separation, opsigelse normalt tager mere tid end indledningen af reaktionerne. Derfor anbefales en ca. 2 min. registreret forsinkelse mellem Indvielserne hvis den samme inkubationstiden skal anvendes på alle prøver.
Princippet om den beskrevne proteolytiske assay er forholdsvis simpelt; men alsidighed i systemet er garanteret af den fleksible og stabile substrat struktur. Den enkelte optimering af analysen kan begrænses kun af affinitet perler forenelighed med de anvendte betingelser, reagenser og tilsætningsstoffer. I overensstemmelse med producentens protokol fandt vi også, at affinitet bindingen af substrater til Ni-NTA perle overflader væsentligt svækker på pH ≤ 6,515. Derfor anbefales det at anvende substrat blindprøver parallelt med reaktion prøver, og satsen for spontan substrat dissociation skal tages i betragtning under evalueringen af resultaterne.
I de tilfælde, hvor magnetisk-perle-baserede assays ikke kan udføres på grund af brugen af perle-uforenelige komponenter eller en lav pH, kan i løsning fordøjelse af de oprensede rekombinant substrater anvendes også. I disse tilfælde reaktion blandinger kan analyseres ved elektroforese, og proteinerne kan visualiseres i gelen baseret på den beskrevne protokol. For at undersøge proteolytiske aktivitet, kan i løsning fordøjelse og i-gel påvisning af proteiner også være alternative redskaber i fluorimetry. En nyhed af designet substrat-systemet er anvendelsen af en i-gel genopretning trin efter denatureringen SDS-PAGE. Mens indfødte (nondenatured) fluorescerende proteiner, bevarer deres fluorescens under elektroforese er egenskaben fluorescerende afskaffet ved denaturering (figur 7B). Dog kan fluorescens af denaturerede proteiner inddrives delvist ved fjernelse af SDS fra gel. Således, en adskillelse af reaktion komponenter ved hjælp af denaturering betingelser gør ikke kun fluorescens-baseret men identifikationen Molekylær-vægt-baserede muligt. En anden fordel ved fluorescerende i-gel påvisning i forhold til analysen af en Coomassie farvede gel er, at de (native eller renatured) fluorescerende proteiner let kan identificeres i gelen baseret på deres fluorescens (Se figur 7). Dette kan være vigtigt, hvis kavalergang reaktioner er udført i prøver indeholdende nonfluorescent forurenende stoffer eller protein, der meget ligner Molekylær vægten af hinanden.
Protease assays bruger ligeledes designet substrater er allerede blevet offentliggjort tidligere8,9,10, og selv om webstedet spaltning af interesse i disse sager var også placeret mellem en affinitet tag og en fluorescerende proteiner, assay systemet præsenteret her ikke kun gentager de beskrevne ideer men kombinerer de forskellige fordele ved de tidligere platforme og også afslutter dem med yderligere forbedringer: i) udnyttelsen af en MBP fusion partner, ii) den tilstedeværelsen af en TEV PR kontrol kavalergang site, iii) brugen af nyligt manipuleret monomere FPs, og iv) anvendelse af en unik substrat kalibreringsmetode. Analysen, selv var specielt designet til at være nyttig for enzymet specificitet og kinetiske studier i en sikker, tid – og omkostningseffektiv måde, uden behov for dyre instrumentation. Metoden har til formål at være et egnet og billig værktøj for både industrielle og akademiske forskningsformål. På grund af fleksibilitet i kloning kassetten af udtryk plasmid, kan systemet være velegnet til hurtig og billig generation af rekombinant substrat biblioteker. Den heri beskrevne assay er et muligt redskab til gennemførelsen af substrat specificitet, enzym mutagenese, og hæmning undersøgelser og også give et alternativ til at udføre enzymkinetik. Assay platform (fra bakteriel celle forstyrrelser til bestemmelse af kinetiske parametre) kan tilpasses til en HTS – og automatisering-baseret miljø og potentielt, kan der anvendes i industrielle protease inhibitor screening og/eller antiviral medicin udvikling. Tilpasning af assay for konkurrencedygtige proteolyse er derudover også fremover omfanget af vores laboratorium. I sådan en konkurrencedygtig assay, to forskellige substrater-hver indeholder en forskellig kavalergang site smeltet til en forskellige C-terminale fluorescerende tag-er beregnet til at bruges samtidig i de samme kavalergang reaktion for at undersøge præference i den undersøgte enzym til de givne mål sekvenser. Desuden er brug af en 96-brønd plade-tilpasset assay form (figur 8) også at være optimeret til mutation screening ved hjælp af en række substrater med modificerede kavalergang site sekvenser i tilfælde af cystein proteaser.
The authors have nothing to disclose.
Værket var delvist understøttet af GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “PHARMPROT teaming” projekt og også finansieres af videregående institutionelle Excellence-programmet af ministeriet af menneskelige kapaciteter i Ungarn, inden for rammerne af den Bioteknologi tematiske program af University Debrecen. Forfatterne er taknemmelig for medlemmerne af det laboratorium for Retroviral biokemi for deres videnskabelige hjælp under assay udvikling og også for deres tålmodighed under optagelserne assay (især til Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz og Vanda Toldi, der vises i baggrunden i videoen). Forfatterne vil også gerne sige særlig tak til Gedeon Richter Plc., især til Dr. Zoltán Urbányi for at tillade Beáta Bozóki arbejde i Institut for biokemi og molekylærbiologi som en Gæsteforsker. Forfatterne ønsker også at udvide deres taknemmelighed over for György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi og Zoltán Király fra multimedie- og E-learning Center for teknisk af Universitet Debrecen for den faglige bistand i lyd og video produktion.
10K Amicon tubes | Merck-Millipore | UFC501096 | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | M6250 | |
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid | Merck | 100063 | |
Agarose | SERVA | 11404.04 | |
Alpha Imager HP gel documentation system | ProteinSimple | ||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A3678 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A9518 | |
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge | Beckman Coulter | 392185 | |
Black half-area plates | Greiner bio-One | 675086 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | B0126 | |
CutSmart buffer (10x) | New England Biolabs | B7204S | For plasmid linearization (step 1.1.1) |
Dark Reader transilluminator | Clare Chemical Research | DR-45M | |
DNase I | New England Biolabs | M0303L | |
Dynamag-2 magnetic particle concentrator | Thermo Fischer Scientific | 12321D | |
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | C600003 | |
Ethanol | Merc-Millipore | 100983 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 798681 | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycerol | Merck | 356350 | |
Glycine | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | G7126 | |
High-Speed Plasmid Mini Kit | GeneAid | PD300 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 56750 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | AM9464 | |
Jouan CR 412 centrifuge | Jouan | CR412 | |
Labinco LD-76 Rotator | Labinco | 7600 | |
Luria-Bertani (LB) broth | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L3022 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L6876 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
MERCK eurolab ultrasonic bath | MERCK | USR54H | |
Millifuge Eppendorf spin centrifuge | Millipore | CT10 | |
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell | Bio-Rad | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T9281 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific | ||
NheI-HF restriction endonuclease | New England Biolabs | R3131L | |
Nickel(II) sulfate (NiSO4) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 656895 | |
Ni-NTA magnetic agarose beads | Qiagen | 36113 | |
Orbital shaker | Biosan | OS-20 | |
PacI restriction endonuclease | New England Biolabs | R0547L | |
PageBlue Protein Staining Solution | Thermo Fischer Scientific | 24620 | |
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P7626 | |
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes | Eppendorf | 22431102 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
Snijders Press-to-Mix shaker | Gemini | 34524 | |
Sodium-acetate trihydrate | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S7670 | |
Sodium-chloride | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S9888 | |
Sodium-hydroxide | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S5881 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fischer Scientific | S7563 | |
T4 DNA ligase | Promega | M180A | |
Thermo shaker | Biosan | TS-100 | with SC-24 accessory block |
Tris | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T1503 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P2287 | |
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter | Wallac Oy, Turku, Finland |