Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

In eukaryotischen Zellen ist DNA hoch verdichteten und in Chromosomen organisierte. ¹ die erste Ebene der DNA-Organisation innerhalb eines Chromosoms ist die Versammlung der Nukleosomen welche 147 bp DNA ist ein Histon Octamer Kern fest umwickelt. ^{2 , 3} Nukleosom Partikel montieren auf einem langen DNA-Molekül bilden ein Chromatin-Array, dann organisiert wird, bis eine kompakte Chromosom Einheit gebildet wird. ⁴ die Demontage des Chromatins Zugriff auf kostenlose DNS durch wichtige zelluläre Prozesse wie gen-Transkription und Genom-Replikation, was darauf hindeutet, dass das Chromatin ist ein sehr dynamisches System. ^{5 , 6 , 7} die dynamischen Eigenschaften der DNA auf verschiedenen Ebenen von Chromatin zu verstehen ist von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der genetischen Prozesse auf molekularer Ebene, wo Fehler zu Zelltod oder die Entstehung von Krankheiten wie Krebs führen kann. ⁸ eine Chromatin-Eigenschaft von großer Bedeutung ist die Dynamik der Nukleosomen. ^{9 , 10 , 11 , 12} die hohe Stabilität dieser Teilchen hat für die strukturelle Charakterisierung von kristallographischen Techniken erlaubt. ² was diese Studien-Mangel sind die dynamischen Details der Nukleosomen wie der Mechanismus der DNA aus dem Histon-Kern Auspacken; der dynamische weg davon ist erforderlich für die Transkription und Replikation. ^{7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16} darüber hinaus sind spezielle Proteine bezeichnet umgestaltet Faktoren gezeigt worden, die Demontage der nucleosomal Partikel¹⁷zu erleichtern; die innere Dynamik der Nukleosomen ist jedoch der entscheidende Faktor in diesem Prozess, der zur gesamten Demontage beiträgt. ^{14 , 16 , 18 , 19}

Einzelmolekül-Techniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenz^19,20,21, optische fallen (Pinzette)^13,18,22,23 und AFM ^{10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26} haben maßgeblich für das Verständnis der Dynamik der Nukleosomen. Unter diesen Verfahren profitiert AFM mehrere einzigartige und attraktive Features. AFM erlaubt es, zu visualisieren und zu charakterisieren, individuelle Nukleosomen sowie längere Arrays²⁷. Von AFM Bilder können wichtige Merkmale der Nukleosom Struktur wie die Länge der DNA um die Histon-Kern gewickelt gemessenen ^10,14,26,28; ein Parameter, der die Charakterisierung der Nukleosom Auspacken Dynamik im Mittelpunkt steht. Vorbei an AFM haben Studien ergeben Nukleosomen hochdynamische Systeme und DNA spontan aus dem Histon Kern¹⁴auspacken kann. Die spontane Auspacken der DNA von Nukleosomen wurde direkt von AFM Betrieb im Zeitraffer-Modus, wenn die Bildgebung in wässrigen Lösungen ^{14,26,29 erfolgt}visualisiert.

Das Aufkommen der High-Speed-Zeitraffer AFM (HS-AFM) Instrumentierung ermöglichte es den Nukleosom Auspacken Prozess um die Millisekunde Zeitskala ^14,15,24zu visualisieren. HS-AFM ^16,30 Studien von spezifischen Nukleosomen Zentromer offenbart einige Neuerungen die Nukleosomen im Vergleich mit den kanonischen Typ. Zentromer Nukleosomen bilden der Zentromer, ein kleiner Teil des Chromosoms für Chromosom Abtrennung³¹von entscheidender Bedeutung. Im Gegensatz zu kanonischen Nukleosomen in loser Schüttung Chromatin enthält der Histon-Kern des Centromers Nukleosomen CENP-A Histon statt Histon H3^32,33. Als Folge dieser Histon-Substitution ist DNA-Verpackung in Zentromer Nukleosomen ~ 120 bp statt der ~ 147 bp für kanonische Nukleosomen; ein Unterschied, der zu verschiedenen Morphologien der Zentromer und kanonische Nukleosomen führen kann arrays³⁴, was darauf hindeutet, dass das Zentromer Chromatin höhere Dynamik im Vergleich mit der Masse eines erfährt. Die neuartige Dynamik angezeigt durch Zentromer Nukleosomen in HS-AFM^16,30 Studien veranschaulichen die einmalige Gelegenheit von dieser Einzelmolekül-Technik zur Verfügung gestellt, die strukturelle und dynamische Eigenschaften direkt sichtbar zu machen Nukleosomen. Beispiele für diese Features werden kurz diskutiert und am Ende des Papiers dargestellt. Diese Fortschritte wurden durch die Entwicklung von neuartigen Protokolle für AFM Bildgebung der Nukleosomen sowie Änderungen bestehender Methoden. Das Ziel des hier beschriebenen Protokolls soll diese spannende Fortschritte in Einzelmolekül-AFM Nukleosom Studien für jedermann zugänglich zu machen, die diese Techniken in ihrer Chromatin-Untersuchungen nutzen möchten. Viele der beschriebenen Techniken gelten für Probleme über das Studium der Nukleosomen und eignet sich für Untersuchungen von anderen Proteinen und DNA-Systeme von Interesse. Ein paar Beispiele für solche Anwendungen finden Sie in Publikationen^{35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49} und Perspektiven von AFM Studien verschiedene Biomolekulare Systeme gegeben in^{29,50,51,53,54}Bewertungen.