Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo
Summary
Cordão umbilical humano (UC) podem ser obtido durante o período perinatal como resultado de pré-termo, termo e postterm entrega. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização de UC-derivado células-tronco mesenquimais (UC-MSCs) de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.
Abstract
Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm considerável potencial terapêutico e atrair o interesse crescente no campo biomédico. MSCs são originalmente isolados caracteriza-se da medula óssea (BM), e adquiridos a partir de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais, tais como a placenta, sangue do cordão umbilical (UCB) e do cordão umbilical (UC). MSCs são uma população heterogênea de células com capacidade para (1) a adesão ao plástico em condições de cultura padrão, expressão do marcador (2) superfície de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenótipos de /HLA-DR– –e (3) trilineage diferenciação em adipócitos, condrócitos, como atualmente definidos pela sociedade internacional para terapia celular (ISCT) e osteócitos. Embora BM é a fonte mais amplamente utilizada de MSCs, a natureza invasiva da aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtidos a partir da UC tem vantagens tais como a capacidade de diferenciação e proliferação vigorosa. Não há nenhuma preocupação ética para amostragem de UC, como é normalmente considerado como lixo hospitalar. UC humana começa a desenvolver-se com o contínuo crescimento da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação e continua a crescer até atingir 50 a 60 cm de comprimento, e pode ser isolado durante o período de entrega todo recém-nascido. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização da UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.
Introduction
Células-tronco mesenquimais (MSCs) são originalmente isoladas e caracterizado da medula óssea (BM)1,2 , mas também pode ser obtidas de uma grande variedade de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais 3. MSCs são reconhecidos como uma população heterogênea de células que pode se proliferar e se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. Além disso, o MSCs possuem a capacidade de migrar para locais de ferimento, suprimir e modulam respostas imunes e remodelar e reparar a lesão. Atualmente, MSCs de diferentes fontes têm atraído interesse crescente como fonte de terapia celular contra uma série de doenças intratáveis, incluindo doença do enxerto – versus – hospedeiro, infarto do miocárdio e infarto cerebral4,5 .
Embora BM é a fonte mais bem caracterizada do MSCs, a invasão de aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtido a partir de apêndices fetais, tais como a placenta, o sangue do cordão umbilical (UCB), e do cordão umbilical (UC) têm vantagens, incluindo preocupações menos éticas de amostragem e robusta de proliferação e diferenciação de capacidade6 , 7. entre fetais apêndices que geralmente são descartadas como resíduos hospitalares, UCB e UC são considerados um órgão fetal, enquanto a placenta é considerado síndrome. Além disso, placenta e UCB precisam ser amostrados e recolhidos no momento da entrega do recém-nascido, Considerando que a placenta e UC podem ser coletadas e processadas após a entrega do recém-nascido. Nesse sentido, UC é uma fonte promissora de MSC para celular terapia8,9.
UC humana começa a desenvolver com a progressiva expansão da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação, continua a crescer até 50-60 cm de comprimento e pode ser isolado durante todo o prazo de entrega recém-nascido10. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional11,12. Neste protocolo, descrevemos como isolar e caracterizar UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs podem ser isoladas em uma variedade de tecidos e são uma população heterogênea de células que fazer express não todos os marcadores fenotípicos mesmos. Aqui, nós esboçamos um protocolo que orienta a coleta e a dissecação da UC de infantes prematuros e de termo e permite o isolamento e cultura de UC-MSCs. Na sequência deste protocolo, isolamos com êxito o UC-MSCs que cumprir os critérios ISCT19 de fetos/recém-nascidos entregues às 19-40 semanas de gestação e demonstrou que el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Grants-in-Aid para Scientific Research (C) (número de concessão: 25461644) e jovens cientistas (B) (conceder números: 15 19614 K, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
Referências
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