Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar clones de células de cáncer que contiene una etiqueta de secuencia de MS2 en un sola subteloméricas. Este enfoque, basándose en el sistema MS2-GFP, permite la visualización de los transcritos endógenos de telomeric repetición que contiene ARN (TERRA) de un telómero solo en las células vivas.
Abstract
Los telómeros se transcriben, dando lugar a telomeric repeat-con larga noncoding RNAs (TERRA), que se han propuesto para desempeñar un papel importante en la biología telomérica, incluyendo formación de heterocromatina y homeostasis de longitud telomérica. Recientes descubrimientos revelaron que las moléculas TERRA también interactúan con regiones cromosómicas internas para regular la expresión génica en las células madre embrionarias (ES) de ratón. En consonancia con esta evidencia, RNA fluorescencia en situ del hibridación (pescado de RNA) análisis han demostrado que sólo un subconjunto de TERRA transcripciones localización en los extremos del cromosoma. Una mejor comprensión de la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción. Aquí, describimos un método para marcar y visualizar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células cancerosas mediante el sistema MS2-GFP. Para ello, presentamos un protocolo para generar clones estables, utilizando la línea celular del cáncer de estómago humano AGS, con secuencias de MS2 integradas en una sola subteloméricas. Transcripción de TERRA de telomere tagged MS2 se traduce en la expresión de moléculas etiquetadas MS2 TERRA que se visualizan por microscopia de fluorescencia de células vivas sobre la expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (GFP-MS2). Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de las moléculas TERRA solo telómeros en células cancerosas, y puede ser aplicado a otras líneas celulares.
Introduction
La larga noncoding TERRA de ARN es transcrito desde la región subteloméricas de los cromosomas y su transcripción procede hacia los extremos del cromosoma, que termina dentro de la zona de repetición telomérica1,2. Por esta razón, las transcripciones TERRA consisten en secuencias subtelomeric deriva en su extremo 5′ y terminan con repeticiones teloméricas (UUAGGG en vertebrados)3. Importantes roles han sido propuestos para TERRA, incluyendo la formación de la heterocromatina en telómeros4,5, ADN replicación6, promoviendo la recombinación homóloga entre cromosoma termina7,8 , 9, regulación de telomere estructura10y telómeros longitud homeostasis2,11,12,13. Por otra parte, las transcripciones TERRA interactúan con numerosos sitios de extratelomeric para regular la expresión génica generalizada en ratón de células madre embrionarias (ES)14. En consonancia con estas pruebas en situ hibridación de RNA fluorescencia (RNA-pescado) los análisis han demostrado que sólo un subconjunto de las transcripciones TERRA localizar en los telómeros1,2,15. Además, TERRA se ha divulgado para formar agregados nucleares de la localización en los cromosomas X e Y en células de ratón2,16. Estos resultados indican que las transcripciones TERRA experimentan dinámicas complejas dentro del núcleo. Comprender la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción.
El sistema MS2-GFP ha sido ampliamente utilizado para visualizar las moléculas de ARN en las células vivas de varios organismos17,18. Este sistema se ha utilizado previamente la etiqueta y visualizar moléculas TERRA solo telómeros en S. cerevisiae12,19. Mediante este sistema, fue demostrado recientemente que las transcripciones TERRA de levadura localización dentro del citoplasma durante la fase de post-diauxic cambio, sugiriendo que TERRA puede ejercer funciones extranuclear20. Recientemente hemos utilizado el sistema MS2-GFP para estudiar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células de cáncer21. Para ello, se emplea la herramienta de edición de genoma CRISPR/Cas9 para integrar secuencias MS2 en un telómero solo (telomere 15q, de ahora en adelante Tel15q) y se obtuvieron clones expresando tagged MS2 endógeno Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). La expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (MS2-GFP) que reconoce y se une MS2 ARN secuencias permite visualización de transcripciones TERRA telómero solo en la vida de las células de21. El propósito del protocolo ilustrado aquí es describir en detalle los pasos necesarios para la generación de clones de TERRA-MS2.
Para generar clones de TERRA-MS2, un cassette de MS2 se integra dentro de la región subtelomeric del telomere 15q, aguas abajo del TERRA promotor región y transcripción Inicio. El cassette de MS2 contiene un gen de resistencia a neomicina flanqueado por sitios lox-p, y su integración en subteloméricas 15q se realiza utilizando el sistema CRISPR/Cas9 del22. Después de transfección de MS2 cassette, solo los clones seleccionados e integración subtelomeric del cassette es verificado por PCR, ADN secuenciada y Southern blot. Clones positivos se infectan con un adenovirus que expresan Cre para quitar el marcador de selección en el cassette, dejando solamente secuencias de MS2 y un sitio de solo lox-p en subteloméricas 15q. Expresión de las transcripciones de MS2-tagged TERRA de Tel15q se verifica por RT-qPCR. Por último, se expresa la proteína de la fusión de GFP MS2 en TERRA-MS2 clones mediante infección retroviral para poder visualizar las transcripciones MS2-TERRA por microscopía de fluorescencia. Transcripciones TERRA pueden ser fácilmente detectadas por RNA-peces y proyección de imagen de células vivas mediante telomeric repeat-específico sonda1,2,15,23. Estos enfoques proporcionan información importante sobre la localización de la población total de moléculas TERRA en la resolución de la célula. La generación de clones que contienen secuencias de MS2 en un subteloméricas solo permitirá a los investigadores a estudiar la dinámica de las transcripciones TERRA solo telómeros en las células vivas, que ayudarán a definir la función y mecanismos de acción de TERRA.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo presentamos un método para generar clones de células de cáncer humano que contiene secuencias de MS2 integradas en subteloméricas 15q. Usando estos clones, las moléculas etiquetadas MS2 TERRA transcritas de subteloméricas 15q son detectadas por microscopía de fluorescencia por la expresión de una proteína de la fusión de GFP MS2. Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de TERRA expresado desde una sola células del telómero en la vida de21. En…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos al personal de la facilidad avanzada de la proyección de imagen del CIBIO en la Universidad de Trento y la instalación de microscopía de luz de BioOptics en el Max F. Perutz laboratorios (MFPL) en Viena. La investigación conduce a estos resultados ha recibido no financiación de la Stiftung Mahlke Obermann y séptimo programa marco de la Unión Europea para la investigación, desarrollo tecnológico y demostración en convenio de subvención 609431 de la CE. CE es apoyado por una beca Montalcini del Ministerio italiano de la Universidad de la educación y la investigación (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
Referências
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