Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host
Summary
Se describen dos ensayos de infección in vitro e in vivo que pueden utilizarse para analizar las actividades de codificación de host factores.
Abstract
Hay una variedad de estrategias de patógenos bacterianos que se emplean para sobrevivir y proliferar una vez dentro de la célula eucariota. El supuesto ‘citosólicas’ patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, pseudomallei de Burkholderia, Francisella tularensisy Rickettsia spp.) tengan acceso al citosol de la célula infectada por físicamente y enzimático degradando la membrana primaria de vacuolares. Una vez en el citosol, estos patógenos tanto proliferan, así como generan fuerzas mecánicas suficientes para penetrar en la membrana plasmática de la célula huésped para poder infectar nuevas células. A continuación, os mostramos cómo esta etapa terminal del ciclo celular de infección de L. monocytogenes (Lm) puede ser cuantificada por ensayos de unidad formadora de colonias y citometría de flujo y dar ejemplos de cómo ambos efectos de factores codificados de patógeno y huésped esto proceso. También mostramos una correspondencia estrecha de Lm dinámica de infección de cultivos de células infectadas in vitro y los de las células hepáticas derivadas de ratones infectaron in vivo. Estos ensayos de función son relativamente simples y pueden fácilmente ampliarse para pantallas de alto rendimiento basado en el descubrimiento de moduladores de la función de la célula eucariota.
Introduction
Modelos experimentales de infección son inherentemente difíciles debido a su dependencia de las condiciones iniciales del estado de la hostia, patógeno, las diversas estrategias de infección del patógeno y la dificultad de atribuir los procesos impulsados por el anfitrión y el patógeno basado en los resultados. La bacteria Listeria monocytogenes (Lm) se ha convertido en un patógeno ideal para sondear respuestas de defensa del anfitrión debido a su maleabilidad genética y microbiológica, su estrategia de infección celular rápida y procesual y el relativamente claro relación entre sus fenotipos de infección del nivel celular y organísmica. La infección celular de Lm procede a través de cuatro fases1: (i) invasión celular que concluye con Lm encasillarse dentro de una vacuola; (ii) Lm-dirigido de la disolución de la membrana de la vacuola y lanzamiento de Lm en el citosol; (iii) intracitosólico replicación; y la penetración física (iv) de la membrana plasmática que resulta en cualquiera de los dos la infección de células directamente adyacentes (tales como una hoja epitelial) o en células solitarias, lanzamiento de Lm en el medio extracelular. Cada una de estas fases son promovidos por específicos Lm-codifican factores (denominados ‘factores de virulencia’) que, cuando borra, causar infección defectos en modelos celulares y animales. Esta estrategia de infección general se ha desarrollado independientemente por un número de los llamados patógenos ‘citosólica’2.
Formadoras de colonias (UFC) de unidad ensayos se emplean extensamente para evaluar tanto in vitro (es decir, celular), así como in vivo (es decir, organísmica) los resultados de la infección. Además de su alta sensibilidad, particularmente para infecciones en vivo, UFC ensayos proporcionan una lectura inequívoca para la invasión de patógenos y supervivencia/proliferación intracelular. Ensayos de UFC se han utilizado para analizar los determinantes de célula Lm y host que afectan a la infección. Tan informativo como han sido estos estudios previos analizar la invasión celular y replicación intracitosólico, ensayos de UFC no, a lo mejor de nuestro conocimiento, se han utilizado para seguimiento de la cuarta fase del proceso de infección de Lm : escape celular. Aquí, describimos relativamente simple vía de escape como celular (en lo sucesivo, ‘aparición’) puede ser controlado por análisis de UFC (así como por el flujo cytometry) y mostrar ejemplos de cómo ambos factores codificados de patógeno y huésped regulan esta fase de la Lm ciclo de infección. El análisis de la fase terminal del ciclo celular de infección de Lm puede posibilitar identificar patógeno adicional y anfitrión célula específica de infección factores y actividades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a su programa de infección celular rápida y procesual, Lm es un patógeno ideal para actividades celulares que afectan a la infección. Se han identificado una serie de factores del huésped que afectan ya sea positiva o negativamente a Lm infección celular11,12,13,14. Estos dos host factores caracterizados en nuestro laboratorio, Perforin-2 y el hemo regulados inhib…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
Referências
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