荧光显微镜竞争滴定法测定转录机-dna 结合感的高灵敏度

1. 偏振显微镜 对于宽场激光照明, 将连续二极管激光器 (40 mw) 的 638 nm 线聚焦在多模光纤的孔径上, 以便进行光束清理。在光纤输出处安装线性偏振器, 以设置激光的偏振。 用双色反射镜 (640 nm 截止) 和带通滤波器 (带通 700/75) 阻止发射光的激发分量。 让荧光信号通过偏振分束器, 该分离器将发射的光拆分为垂直和平行的偏振分量。然后, 将非反射光束 (平行组件) 和反射光束 (垂直组件) 聚焦在背光 em-ccd 摄像机的芯片上, 并带有 200 mm 焦距的无色透镜 (图 1b 和 1c)。使用镜子调整垂直光束朝向镜头的方向。 2. 荧光标记参考 dna 低聚物的设计与测试 确定参考 dna 的核心序列: 该方法基于一种竞争分析, 该方法测量转录因子与未标记的竞争对手 dna 低聚物之间的离解常数 (kd2), 这些 fna 低聚体与荧光标记的 dna, 其与 tf 的亲和力起到参考 (kd1) 的作用。从 dnase 足印或细菌 1 – 等其他来源获得的共识序列可以作为起点5,15。注: 根据经验法则, 与共识序列相比, 合适的参考 dna 与 tf 的结合亲和力降低了3至7倍。 由 hp-fa 测量在上一步中得出的共识序列的2-3 个试探性单突变的 kd1。尝试在协商一致的顺序中改变不太具体的立场, 以避免完全丧失绑定。注: 重要的是, 参考序列是由感兴趣的转录因子 (我们在本协议中使用), 但不要太强烈, 以便较弱的竞争对手可以超过它在高浓度。 通过在两侧添加对称侧翼序列 (添加侧链以进行适当的绑定), 将核心母题 (通常为8-12 基对) 的长度延长到16个基对或更多基对。如有必要 (例如, 对于较长的投标域), 请使用较长的序列 (使用 hip-fa 分析测试了长度达约50个碱基对)。注意: 请注意不要添加预期会创建异位绑定站点的基础。使用从可用 pwm 预测绑定站点的计算工具来促进这一过程 (例如, pysite22)。 作为标记的参考 dna, 在 3 ‘ 或 5 ‘ 端荧光标记的低聚物。例如, 在水中使用 cy5、bodipy-650 或浓度为 10μm (100μm 10倍库存) 的任何其他合适的染料, 并按照步骤3.1 中的说明逐步稀释。 在蒸馏水中加入 33 mm 磷酸钾缓冲液 (ph = 7.0)、90 mm 氯化钠和0.01% 的非离子洗涤剂, 制备500毫升的1x 结合缓冲液。还准备3x 结合缓冲液, 其中包含相同的成分, 但浓度为三倍。如果使用3x 绑定缓冲区作为1x 绑定缓冲区的库存解决方案, 请准备卷 > 500 ml;否则, 准备250毫升。注: 该组合物经过优化, 可确保转录因子稳定性和谷胱甘肽 s-转移酶 (gst) 二聚化。 在玻璃底部显微镜96井板 (不同 tf 浓度的5-6 井) 中存在不同数量的 tf 的情况下, 用步骤1中描述的显微镜设置测量含有 0.8 nm 标记参考 dna 的200μl 结合液的 fa确定要使用的 tf 浓度。进行滴定系列, 增加 tf 量, 并选择曲线到达高原的浓度进行测定, 表明 dna 参考低聚物的完全结合。注: 最佳 tf 浓度取决于 tf-dna 离解常数的值。一般来说, 较低的 kd 需要较低的浓度。 3. 低聚物退火 要退火标记参考 dna 的 dna 低聚物 (在上一步确定的序列), 请在186μl 水中混合10mm 染料标记的正向单链 dna 溶液和10mm 浓度的7μl 及其未标记的反向补体。 对于竞争对手的 dna 序列, 将正向单链 dna 的 20μl (在制造商提供的水中) 与20μl 的 100 mm 对应的反向单链 dna 混合在一起, 以应对每个要测量的竞争对手序列。 在标准 pcr 循环中分别进行退火, 方法是将溶液加热到 70°c 3分钟, 并以 0.1 k/的速度将温度降低到 rt。如果使用的 pcr 机器不支持该速率的温度梯度, 只需在温度降低的情况下进行逐步孵育 (测试的周期为99个周期, 每个周期为-0.4 k)。 4. 凝胶制备 注: 以下部分解释了两种不同凝胶的制备方法: 1) 滴定井含有蛋白质凝胶, 用于确定各自竞争对手 dna 序列的 kd s,2) 校准井利用 nb确定每个给定时间点和采集高度的 dna 浓度。重点是在96孔板的实验准备上, 但也指出了384孔板格式的相应体积。 在实验室微波炉中煮沸, 将 0.5% w/v 低熔点琼脂糖溶解在结合缓冲液中。完全溶解后, 用 ddh2o 再次调整体积, 以补偿可能的蒸发。注: 为方便起见, 请准备一份10-20 毫升10毫升凝胶的库存, 并在需要时在75°C 将其熔化。凝胶库存可以存放在 rt。注意: 请注意避免在微波炉中对凝胶溶液进行过热加热。加热时间间隔短, 中间晃动是可取的。 在振动条件下, 首先在75°c 下熔融两种 10 ml 凝胶库。 对每个竞争对手使用 240μl (包括20% 的开销) (n = 竞争对手序列的数量)。 使用相同体积的凝胶进行 nb 校准, 以确保两个凝胶的温度和粘度相等。 然后将温度设置为 35°c, 并等待温度平衡。 对于滴定井, 在96中加入 1.4 nm (最终浓度) 杂交参考 dna (在步骤3中获得)、tf 蛋白 (最终浓度 c tf = 20-60 nm, 在步骤2.6 中确定)、dtt (0.2 mm) 和结合缓冲液, 总体积为 n x 200μl 或 n x 13 微米-或384孔板格式, 分别 (加上开销)。通过反转 (不旋涡) 彻底混合。 在上一步中制备的凝胶溶液在96孔板格式 (386 井采用 13μl·well) 中缓慢加入每口 200μl, 加入滴定井。 对于校准井, 首先在井外的融化凝胶中添加 5 nm nM (总量取决于所使用的井板格式和校准井的数量; 通常每个井板5-6 个就足够了)。 将含有凝胶的 nb 在井板滴定井内缓慢地进行 200μl (13μl 为384井板格式), 并确保避免气泡。注: 使用电子插座或机器人可显著提高重现性。 让凝胶在 rt 固化 10分钟, 在4°c 时再固化 10分钟 (如有必要, 请在之后从玻璃中去除冷凝物)。请确保在完全水平的表面上执行所有这些步骤, 以避免凝胶表面不均匀。注: 含有凝胶的蛋白质在4°c 下通常至少稳定几个小时。 5. 添加竞争对手 dna 解决方案 注: 在开始滴定之前, 应准备好以下溶液, 并同时添加到校准和滴定井的顶部。 在3倍的结合缓冲液中加入经过退火标记的参考 dna 和蛋白质, 浓度比凝胶用量高3倍。 将所获得的溶液的20μl 与步骤3中获得的每个退火竞争对手 dna 溶液的40μl 混合。 对于每个校准井, 将含有 15 mm nb 溶液的3μl 结合在一起, 再加上40μl 的退火竞争对手 dna (任何相同长度的序列都适用)。注: 对于384孔板, 请使用 21μl, 而不是总共60μl。 (可选) 通过测量 380 nm 的吸收率, 使用多井板读取器 (吸收率与凝胶高度成正比), 从光谱的角度检查不同油井凝胶高度水平的均匀性。 在凝胶上加入 50μl (384 孔板格式为 7μl) 混合竞争对手 dna 溶液 (在步骤3中退火)。尝试使用电子多通道移液管或96通道移液头 (如果可用) 尽可能同时添加所有竞争对手的解决方案。添加竞争对手解决方案后, 将板材放置在显微镜舞台上, 并立即开始测量 (步骤 7)。 6. 图像采集 按顺序获取时间序列的z堆栈 (例如,使用12个平面和10-300 毫秒的照明时间)。避免拍摄离井面太近的图像 (< 与本文使用的板的角度为1.4 微米), 以排除任何偏振偏置。 执行10-25 个周期的测量, 直到 tf 中标记的参考 dna 完全取消结合。端点通常在1-2小时后到达, 具体取决于竞争对手 dna 的结合动力学和扩散性。 7. 从原始数据中提取fa (z, t) 一旦对井板进行了成像, 就从原始荧光图像中计算出平行 (i=) 和垂直 (i+) 偏振强度分量感兴趣区域的平均像素值 (图 1c)。这可以使用 hp-fa 软件23自动完成。注: 可下载 hp-fa 软件、说明书和测试数据集 23.或者, 使用任何其他自定义编写的软件提取 i=和 i+ , 并执行滴定曲线的下游分析, 如下文详细介绍。 计算每口井的 fa。对于每个井, 脚本根据以下情况计算每个 z 位置和时间点t 的 fa (z, t) :等式 1:其中 g 是仪器 g 因子, 纠正任何偏置到垂直通道。 通过测量含有已知各向异性荧光染料的任何溶液的 fa 来确定显微镜设置的 g 因子。提取信号的两个偏振分量, 然后使用公式1获取g , 知道解的 fa (在此设置中g = 1.15)。 8. 测定ffanb 中竞争对手 dna 浓度的校准曲线 退火每个正向和反向参考低聚物 (100 mm 库存浓度; 可使用与竞争对手序列长度相同的任意随机序列), 并与含有 nM (15 nm) 的3x 结合缓冲液120μl 混合。 在1x 结合缓冲液中制备 1: 2 稀释系列, 共6个稀释。将这些稀释剂的50μl 与0.5%–低熔点琼脂糖 (t > 35°c) 的200μl 混合在含有 5 nm nM 的1x 结合缓冲液中, 在三联中含有 5 nm。 在96孔板中添加上一步制备的6个溶液中的每一种, 并将板在4°c 下存储 1小时, 以确保完全凝胶化, 然后在 rt 中1小时使用 hap-fa 设置测量溶液的 fanb. 根据上一步提取fanb (z, t) , 并使用 hill 方程拟合数据:等式 2:其中 cdna 是 dna 低聚物的浓度;k 一半结合位点被占领的 dna 低聚物的浓度;fa最大值是一个归一化常数;n是希尔系数。在装配过程中, k 、fa 最大值和n被设置为自由参数。 输入从 hap-fa 软件中的拟合过程中获得的三个参数 (在左侧的下面板中)。 每隔几个月或在显微镜设置中进行更改后, 重复确定校准曲线。 9. 竞争对手 dna 浓度的测定 使用 hp-fa 软件从fanb(z, t)测量中提取 c (z, t) (图 3)。首先获取上一节中所述的校准曲线, 并输入软件的拟合参数 (有关详细信息, 请参阅手册)。 使用该程序自动外推 c (z, t)为 c < 100 nm (请参阅手册的详细信息) 使用公式 3 (图 3b), 它描述了竞争对手 dna 在琼脂糖凝胶基质内的一维扩散, 假设自由扩散。等式 3:其中 c0是竞争对手 dna 的初始浓度;erf是错误函数;z是位置;d是竞争对手 dna 的扩散系数;并且 t0是测量的开始时间。使用的自由参数为 c0和z/. 10. hip-fa 常规竞争滴定对非常强的 dna 结合 在96孔板 (或384孔板) 的行中, 以以下浓度对不同的竞争对手 dna 低聚物进行串行稀释: 0、1.25、3.5、9、19、45、90、190、425、900、1900和 4000 nm。在一个恒定浓度下加入 cy5 标记的参考 dna (1 nm) 和 tf (20-50 nm), 在结合缓冲液中, 每口井的总体积为 200μl (图 5a)。等待 40分钟, 直到达到热力学平衡, 并获得 (与 hp-fa 设置) z 堆栈的每口井 (获取几个图像每口井减少变异性通过平均计算的 fa 值)。 构造平衡结合滴定曲线, 并将其与公式 4 (图 5b) 相匹配。传统竞争滴定法测定的kd 与hip-fa 用琼脂糖凝胶基质20 测定的 k d 相同。 11. fa 滴定曲线的拟合程序 在 hap-fa 软件中显示单个竞争对手序列 fa (z, t) = f [c (z, t)] 的重建滴定曲线, 并直观地检查数据质量 (详见手册)。如果需要, 在步骤10中细化用于测定竞争对手 dna 浓度的参数。 使用公式4自动拟合每个单独的滴定曲线, 该公式为竞争性滴定检测24 提供了一个分析解决方案。等式 4:使用:其中rt 是蛋白质浓度;lt 为未标记, lst 为标记 dna 浓度;kd2 是待定的离解常数;rt是活性蛋白的浓度;a和b是规范化参数。首先确定kd1, 它可作为确定不同kd2 值的参考。通过 选择染料参考 dna 序列作为未标记竞争对手 dna 的序列, 可以很容易地通过检测来确定 k d1 (参见手册)。 在软件中输入获得的 kd1 值, 并计算板上所有竞争对手 dna 的 kd2值。注: 拟合过程的自由参数为kd2、 r t、 a和b. 通过单击软件中的 “导出” 按钮, 为板材的所有 个别滴定液导出离解常数kd2 和活性蛋白 r t 浓度。 12. pwm 构造、蛋白质-dna 相互作用的特异性和伪计数 如前面所述, 使用在线工具 weblogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) 为不同的 pwm 创建序列徽标。