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Bioengenharia

Flash NanoPrecipitation para la encapsulación de compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos en nanopartículas poliméricas

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58757
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

Flash NanoPrecipitation (FNP) es un enfoque escalable para producir nanopartículas poliméricas de core-shell. Se describen formulaciones de escala de laboratorio para la encapsulación de la terapéutica hidrofóbica o hidrofílica.

Abstract

La formulación de un compuesto terapéutico en nanopartículas (NPs) puede impartir propiedades únicas. Para fármacos poco solubles en agua, formulaciones de NP pueden mejorar la biodisponibilidad y modificar la distribución de droga dentro del cuerpo. Medicamentos hidrofílicos como proteínas o péptidos, encapsulado dentro de NPs también puede proporcionar la protección de los mecanismos de separación natural. Hay algunas técnicas para la producción de NPs poliméricos que son escalables. Flash NanoPrecipitation (FNP) es un proceso que utiliza ingeniería geometrías mezcla para producir NPs con distribuciones de tamaño estrechas y armoniosas tamaños entre 30 y 400 nm. Este protocolo proporciona instrucciones acerca de la producción a escala de laboratorio de nanopartículas poliméricas core-shell de un tamaño de destino mediante FNP. El protocolo se puede implementar para encapsular compuestos hidrofílicos o hidrofóbicos con sólo pequeñas modificaciones. La técnica puede ser empleada fácilmente en el laboratorio a escala de miligramo a las formulaciones de la pantalla. Hits de plomo pueden directamente ampliarse a escala gramo y kilogramo. Como un proceso continuo, escala-para arriba implica ya la mezcla tiempo de proceso que se ejecute en lugar de traducción a los buques nuevos de proceso. NPs de FNP son altamente cargados con terapéutica, disponen de un cepillo denso de polímero estabilizador y una reproducibilidad de ± 6% de tamaño.

Introduction

Desde finales de 1990, ha habido un aumento constante del número de ensayos clínicos empleando nanomateriales1,2. El creciente interés refleja la promesa de los nanomateriales para mejorar la biodisponibilidad de fármacos hidrófobos y orientación preferencial dentro del cuerpo3. Nanopartículas poliméricas (denominadas nanopartículas o NPs aquí) representan una proporción creciente de esta clase de materiales2. NPs han recibido interés porque tienen propiedades altamente ajustables tales como tamaño, composición y funcionalización de superficies4. Cuando se aplica a la administración de fármacos poco solubles, NPs tienen con frecuencia una estructura core-shell donde la terapéutica se encapsula en el núcleo hidrofóbico y la cáscara consiste en un cepillo de polímero hidrofílico. Una manera simple de generar esta estructura emplea un copolímero del diblock anfifílicas (BCP) que consiste en un bloque hidrofóbico degradable, que forma parte de la base de la partícula, y bloque de un poly(ethylene glycol) hidrofílico (PEG), que forma el cepillo de polímeros y imparte estabilización estérica4,5.

Nanoprecipitation es una técnica común de la fabricación de nanopartículas poliméricas porque es simple y no energía intensiva6. En su forma más simple, nanoprecipitation implica además con una pipeta de componentes de la NP en un solvente orgánico como la acetona a un volumen de exceso de agua agitada. El cambio de solvente a una solución acuosa diluida da como resultado la precipitación del componente insoluble de la base. El estabilizador se monta sobre esta superficie creciente de la partícula, dirigido por la adsorción de la derrumbada hidrofóbico bloque7,8,9,10. Una distribución de tamaño de partícula uniforme se obtiene cuando el solvente y el agua mezclan rápidamente para formar una solución homogénea. Mezcla es más lento que la nucleación y Asamblea de los resultados de los componentes en un más grande, más población de partículas polidispersas. Aunque accesible para una prueba simple, el enfoque de lote agitada produce gran variabilidad debido a la inconsistencia de la mezcla y no es susceptible de ampliación6,11. Microfluídica ha surgido como otra vía para la producción de NP que puede funcionar continuamente. Este medio de producción ha sido recientemente revisado por Ding et al. 11 . Un enfoque común utiliza flujo laminar enfoque para reducir la escala de longitud solvente a valores sub-micron. Mezcla de la antisolvent ocurre por difusión, por lo que las dimensiones de pequeño flujo son cruciales para partículas uniformes11,12. Paralelización de múltiples cámaras de microfluidos para escala-para arriba es problemático para los volúmenes de producción grandes.

Las condiciones de mezcla rápidas que favorecen nanoprecipitation uniforme en microfluídica alternativamente se pueden producir en confinado, flujo turbulento. Flash NanoPrecipitation (FNP) emplea geometrías mezcla especiales para conseguir estas condiciones mayor caudal volumétrico que posible con la microfluídica. Corrientes de entrada entrar en una cámara de mezcla bajo condiciones turbulentas que conducen a la generación de vórtices, para que solvente/anti-solvent laminillas forman sobre la escala de la longitud de difusión11,13. Así, se logra una mezcla uniforme en una escala de tiempo más corta que la nucleación y crecimiento de la terapéutica. La geometría confinada de la mezcladora no permite que corriente pasando por alto de la región donde se produce la disipación de la energía turbulenta y todo el sistema experimenta el mismo proceso historia13. Nucleación se produce uniformemente en la cámara de mezcla y crecimiento de partícula procede hasta por la Asamblea de BCP sobre la superficie9,14. El flujo mixto que contenga partículas estables entonces puede diluirse con antisolvent adicional para suprimir Ostwald de maduración de las partículas15,16,17.

Un confinado inmiscuían mezclador del jet (CIJ) es el más simple diseño de mezclador para la FNP y permite la mezcla de dos corrientes de manera escalable y continua, como se muestra en la figura 1A13. Un mezclador de tipo vórtex de entrada múltiple (MIVM) fue desarrollado para permitir a hasta cuatro entradas de corriente diferentes logrando aún la micromixing rápida necesaria para la formación de la partícula uniforme, como se muestra en la figura 1B18. FNP permite proyección de formulación simple que puede ser traducido fácilmente a la producción a escala comercial. Tamaños de hornada más grandes debido a la naturaleza continua del proceso, no requieren de nuevos buques pero algo más de largo tiempos de ejecución, traducción simple permitiendo a la producción a escala de kilogramo en el mismo tren de equipo.

Compuestos hidrófilos como péptidos y proteínas (‘biológicos’) también pueden ser encapsulados en un proceso llamado inverso NanoPrecipitation Flash (iFNP). La técnica requiere un anfifílicas BCP donde una cuadra es hidrófoba y el otro es un polyacid19. El paso inicial consiste en una mezcla rápida de una corriente de dimetil sulfóxido (DMSO) que contiene el biológico y el BCP contra un solvente lipofílico como el diclorometano o cloroformo. Esto resulta en la formación de partículas estabilizadas con el cepillo de hidrofóbico bloque. Aquí, tal arquitectura se denominar un NP ‘invertido’. El núcleo contiene la polyacid, que luego es ionizada reticulado con un catión multivalente. Esto estabiliza las partículas para su procesamiento en un ambiente acuoso en forma de micropartículas o nanopartículas recubiertas de PEG por técnicas que se han divulgado en la literatura19,20,21.

Este protocolo puede ser empleada para la producción a escala de laboratorio de nanopartículas poliméricas de core-shell encapsulando compuestos hidrofóbicos o hidrofílicos. Las subdivisiones del protocolo proporcionan instrucciones sobre el uso de ambas clases de mezclador – el CIJ y la MIVM. El lector debe ser capaz de adaptar el protocolo para componentes nuevos y reproducible generar nanopartículas de tamaño deseado usando el mezclador apropiado para las entradas de corriente. A continuación se presentan tres formulaciones de ejemplo mediante FNP y iFNP. Dos emplean el mezclador de la CIJ y uno requiere el MIVM15,22. La primera formulación muestra la encapsulación de un modelo hidrofóbico compuestos por FNP. La segunda formulación muestra la encapsulación de un modelo de hidrofílico compuesto por iFNP en un mezclador CIJ. La formulación final proporciona un ejemplo de encapsulación de proteínas por iFNP usando un MIVM. El protocolo para esta tercera formulación describe el uso de una pequeña escala, mano MIVM denominado ‘μMIVM’. El diseño de mezclador es más pequeño para permitir la proyección de formulación simplificada, pero se entiende bien el comportamiento del escalado y el mezclador no es un dispositivo de microfluidos22. La sección final del protocolo incluye algunas notas en la escala de plomo formulaciones identificados en el cribado. Estas formulaciones están destinadas a proporcionar puntos de acceso para el proceso de aprendizaje y por tanto utilizar no degradables poli (estireno)-basado en polímeros. Estabilizadores alternativos se han descrito en la literatura, con un número de opciones comerciales biocompatibles disponibles14,23,24.

Protocol

1. encapsulación de compuestos hidrófobos en NPs poliméricos con un mezclador de CIJ Preparar y limpiar el equipo. Adquirir y validar un mezclador CIJ.Nota: Ver Información complementaria del artículo 1 para la dirección de construcción. Archivos CAD están disponibles como Información complementaria . Antes de cada uso, asegúrese de que están ajustadas todas las conexiones en el mezclador CIJ y el tubo de salida no es doblado o pellizcado. En una campana de humos, conecte una jeringa con cierre luer 5 mL que contienen 2-3 mL de solvente para cada adaptador de entrada. Seleccione un solvente (por ejemplo, acetona) que limpiará cualquier compuestos recientemente utilizados en el mezclador.Nota: Las selecciones típicas son acetona o tetrahidrofurano (THF). Sólo polipropileno jeringas para evitar problemas de compatibilidad solvente como lixiviación. No use jeringas con émbolos de sello de junta tórica de goma. Establezca la Asamblea de la CIJ sobre un contenedor de residuos.Nota: Un frasco con una abertura más pequeña que el cuerpo CIJ funciona bien ya que es compatible con la mezcladora y permite la operación fácil de las jeringas. Presione constantemente los émbolos para vaciar el contenido a través de la cámara de mezcla durante unos segundos. Retire las jeringas.Nota: Las jeringas pueden conservarse y reutilizadas para múltiples rondas de limpieza entre FNP. Seque la CIJ mezclador funcionamiento interno mediante una secuencia de N2 . Un adaptador luer macho en el extremo de una línea de2 N es eficaz.Nota: Si el solvente de limpieza no es volátil (por ejemplo, DMSO), repita los pasos 1.1.3-1.1.5 con acetona o THF antes de proceder al paso 1.1.6. Es crucial eliminar el solvente residual para la consistencia de la prueba a prueba. Preparar flujos de solvente y antisolvent en composiciones de destino. Disolver el compuesto hidrofóbico (es decir, vitamina E) en THF inestabilizado 10 mg/ml en cantidad suficiente para completar el número deseado de los funcionamientos de la FNP. Preparar algo más necesarios por ejecutar.Nota: Pueden utilizarse otros solventes en estos pasos, sujeto a las restricciones en la sección de discusión. Si el empleo de THF, solvente sin estabilizador se recomienda porque butilhidroxitolueno tiene baja solubilidad en el agua. Tenga cuidado para evitar la acumulación de peróxido (incluyendo pruebas peróxido) y ten en cuenta que los bajos niveles de peróxidos pueden interferir con determinadas aplicaciones de NP (por ejemplo, decoloración de tintes). Mezcle la solución de vitamina E en un mezclador de tipo vórtex hasta que se disuelva.Nota: Para algunos compuestos, sonicación baño para 1-2 min puede ayudar a generar una solución disuelta. Es importante que todos los componentes de NP molecularmente se disuelven. Disolver el estabilizador de copolímero de bloque (es decir, poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS1,6 k-b-PEG5 k) en THF a 10 mg/mL en aproximadamente el mismo volumen que en el paso 1.2.1 para formar la solución de polímero.Nota: Otros disolventes pueden utilizarse, sujeto a las restricciones detalladas en el apartado de discusión. Mezcle la solución de polímero con un mezclador de tipo vórtex hasta que se disuelva. Si es necesario, colocar la solución en un baño de sonicación durante 1-2 min ayudar en la disolución de sólidos.Nota: El polímero no puede ser en forma micelar. Dispersión ligera dinámica (DLS) puede ser una herramienta útil para determinar si una nueva composición de la corriente cumple este criterio. Crear la secuencia de entrada de solvente que contiene 5 mg/mL de vitamina E y el estabilizador (carga de vitamina E 50%) por primer pipeteo 0.25 mL de la solución de vitamina E en un tubo de centrífuga de 1.5 mL. Luego pipetear 0.25 mL de la solución de polímero en el mismo tubo.Nota: Volúmenes de más de 0,5 mL por ejecutar son factibles con tamaños de jeringa diferente. Sobre el volumen de entrada de 10 mL, es práctico utilizar una bomba de jeringa. Mezclar en un vórtex para 5-10 s. opcionalmente, centrifugar el tubo a 1000 x g por 5-10 s recuperar cualquier líquido pegado a la tapa, que mejora la reproducibilidad entre tramos CIJ. Pipetee 0,525 mL de agua desionizada en un segundo tubo de centrífuga de 1,5 mL como la corriente antisolvent.Nota: Es mejor tener exceso antisolvent, que asegura que el flujo de solvente nunca entra en la cámara de mezcla sin antisolvent presente. En algunos casos donde no está limitando la solubilidad de la sal en la mezcla de solvente/antisolvent, pueden utilizarse con sistemas acuosos. Pipetear 4 mL de agua desionizada en un vial de centelleo de 20 mL u otro recipiente adecuado como un baño de Temple. Coloque una barra de agitación magnética pequeña en el frasco.Nota: El baño de Temple reduce al Ostwald maduración disminuyendo el contenido de solvente final al 10% por volumen15,17. Este volumen puede ajustarse a las limitaciones del proceso de dirección y puede escalarse directamente con el volumen de flujo de entrada. Producir el NPs por FNP con el mezclador de la CIJ. Coloque el frasco de baño de Temple abierto abajo el mezclador limpio de CIJ sobre una placa de agitación en una campana de humos. Una configuración práctica utiliza un bloque de bastidor de tubo de ensayo de 50 mL para apoyar la CIJ la mezcladora con el frasco por debajo y la tubería de salida indicado en el frasco. Vea la figura 1A para la orientación. Comience removiendo el quench baño a través de la barra de agitación magnética en alrededor del 75% velocidad máxima. Utilizando una jeringa de polipropileno de 1 mL con una aguja de punta Roma, dibujar el volumen completo del tubo antisolvent.Nota: No use jeringas que contienen un sello de junta tórica de goma para evitar problemas de compatibilidad. Para volúmenes más grandes de entrada, use una jeringa con cierre luer tamaño adecuado. La salida de la jeringa debe estar centrada en el eje de la jeringa o va a ser inestable durante la depresión. Con cuidado retirar todas las burbujas de aire de la jeringa y retire la aguja de punta Roma, deseche en un contenedor de objetos punzantes. Cebe el émbolo para que la corriente llega a la apertura de la jeringa. Conecte la jeringa a una de las conexiones de entrada de la CIJ. Repita los pasos 1.3.3-1.3.5 para la solución solvente. Rápidamente, suavemente y uniformemente Presione las jeringas a la vez mediante la colocación de la bola de la mano, la palma de la mano o un dedo pulgar en la parte superior de los émbolos dependiendo de sus preferencias personales. Recoger el efluente en el frasco de baño de Temple.Nota: Un 0, 5 mL de entrada debe ser presionado en menos de 0,5 s. Dejar de lado la CIJ mezclador con las jeringas fijadas. Quitar la barra de agitación y tapa el frasco, que contiene ahora la dispersión de la NP con una estructura de partículas core-shell (figura 1). Sujete la batidora sobre un contenedor de la solución inútil y retire las jeringas. El volumen de retención (aproximadamente 0,25 mL) luego se drenará hacia fuera. Desechar las jeringas usadas y repetir la limpieza 1.1 antes de la próxima prueba de FNP.Nota: No permita que el volumen de retención para vacío en el frasco que contiene el NPs como esto impactara negativamente la uniformidad de la muestra. Realizar análisis y post-procesado de dispersión de NP. Para caracterizar el tamaño de la NP con DLS, Pipetee 100 μL de la dispersión de NP en una cubeta de plástico y agregar 900 μL del solvente de baño de Temple (e.g., agua).Nota: Volúmenes más pequeños pueden usarse para cubetas de bajo volumen. Una dilución 10 veces es suficiente. Mezclar por pipeteo arriba y abajo o por agitación suave. Siga las instrucciones específicas de ciertos instrumentos para analizar la muestra.Nota: Técnicas de caracterización alternativa tales como análisis de potencial zeta o la microscopia electrónica puede llevarse a cabo como necesario. La dispersión de NP puede ser procesada más lejos como dictadas por la aplicación y revisada en la sección de discusión. 2. encapsulación de compuestos hidrófilos en NPs invertidas con un mezclador de CIJ Preparar disolvente antisolvent y saciar soluciones en campana. Completar los procedimientos de limpieza y preparación que se describe en el paso 1.1, utilizando DMSO como solvente de limpieza y adhesión a la nota en el paso 1.1.6 para completar un segundo enjuague con THF. Disolver el compuesto hidrofílico (por ejemplo, maltodextrina (MD) con equivalente de dextrosa (DE) de peso molecular 4-7, = 3.275 g/mol, “3 k MD”) en DMSO 10 mg/ml en un volumen suficiente para completar el número deseado de FNP funciona.Nota: Otros disolventes pueden utilizarse, sujeto a las restricciones descritas en la sección de discusión. Mezcle la solución de maltodextrina con un mezclador de tipo vórtex hasta que se disuelva. Si es necesario, colocar la solución en un baño de sonicación durante 1-2 min ayudar en la disolución de sólidos. Crear un estabilizador de copolímero de bloque (es decir, poly(styrene) -b- poli (ácido acrílico), PS5 k-b- PAAk 4,8) stock solución de THF en 11,1 mg/mL en aproximadamente el mismo volumen que en el paso 2.1.2 para formar la solución de polímero .Nota: Pueden utilizarse otros solventes y concentraciones de estabilizador. Fácilmente puede utilizar DMSO como solvente en lugar de THF. Mezcle la solución de polímero con un mezclador de tipo vórtex hasta que se disuelva. Si es necesario, colocar la solución en un baño de sonicación durante 1-2 min ayudar en la disolución de sólidos.Nota: La entrada de polímero no puede ser en forma micelar. DLS puede utilizarse para determinar si una nueva composición de la corriente cumple este criterio. Preparar la entrada de flujo de solvente (0,5 mL) mediante la combinación de los siguientes, en orden, en un tubo de centrífuga de 1.5 mL: 0,250 mL de la solución de k MD 3, 0,225 mL de solución de polímero y 0,025 mL de agua desionizada.Nota: El contenido de agua de este arroyo tiene un fuerte impacto en el tamaño de la NP y la polidispersidad. Generalmente es mejor operar en el 2.5-10 vol % gama20. Valores de high-end de la gama pueden ayudar a la encapsulación de compuestos de peso molecular más grandes. Mezclar en un vórtex para s 5-10. Opcionalmente, centrifugar el tubo a 1000 x g por 5-10 s recuperar cualquier líquido pegado a la tapa, que mejora la reproducibilidad entre tramos CIJ. Preparar una solución de crosslinker de dihidrato de cloruro de calcio (CaCl2) en metanol a 25,0 mg/mL.Nota: El crosslinker se añadirá en una proporción de 1:1 de carga a los grupos ácidos en el bloque de la PAA. Ajustar en consecuencia la concentración si se utiliza un crosslinker diferentes o diferentes PAA bloque tamaño o polímero concentración usada20,21. Preparar la secuencia antisolvent pipetear 0.5 mL de cloroformo y 0,05 mL de la solución del crosslinker (0,55 mL total) en un tubo de microcentrífuga.Nota: Otros antisolvents aceptables son dictadas por la elección de copolímero de bloque y suelen incluyen el diclorometano o acetona. El crosslinker en cambio puede añadirse al baño de Temple, con el envejecimiento adicional de la dispersión de NP para permitir la formación de reticulación20. Mezclar en un vórtex para s 5-10. Opcionalmente, centrifugar el tubo a 1000 x g por 5-10 s recuperar cualquier líquido pegado a la tapa, que mejora la reproducibilidad entre tramos CIJ. Añadir 4 mL de antisolvent (es decir, cloroformo) a un vial de centelleo 20 mL para formar el baño de Temple. Coloque una barra de agitación magnética pequeña en el frasco.Nota: Este volumen puede ajustarse a las limitaciones del proceso de dirección. Completar el protocolo para la formación de NP como se describe en el paso 1.3. Realizar análisis y post-procesado de dispersión de NP. Para caracterizar el tamaño de la NP con DLS, Pipetee 100 μL de la dispersión de NP en una cubeta de vidrio y agregar 900 μL del solvente utilizado para el baño de Temple. Mezclar por pipeteo arriba y abajo o ligera agitación de la cubeta. Siga las instrucciones de software para analizar la muestra.Nota: Entrecruzamiento de NPs puede ser evaluada cualitativamente por DLS con un buen solvente como DMSO o dimetilformamida (DMF) como diluyente DLS20. Las partículas que son estable reticulado presenta una función de autocorrelación en el solvente con un cambio mínimo en el tamaño de las partículas. Las partículas pobremente reticulado se hinchan y presentan una función de autocorrelación débil y dispersión fuerza21. Opcionalmente, añadir una base, como amoníaco, formación de complejos iónico y fortalecer la reticulación en el núcleo de la partícula. Opcionalmente, prepare una solución de 3,48 mg/mL de amoniaco en metanol gravimétrico con solución de hidróxido de amonio (por lo general, amoniaco 30% peso). Añadir 50 μL (es decir, 0,6 equivalentes con respecto a los grupos ácidos en el polímero) gota a gota con agitación.Nota: Los equivalentes se pueden ajustar si desea variando ya sea la concentración o el volumen añadido25. Opcionalmente, la edad no menos de 30 min con suave agitación para la reticulación a ocurrir. Proceso de la dispersión de NP para producir micropartículas o NPs cubiertos como se describe en la literatura19,20,21. 3. encapsulación de ovoalbúmina en NPs invertidas con un μMIVM Preparar soluciones de solvente y antisolvent. Preparar una solución de 50 mg/mL de ovoalbúmina en agua desionizada (“OVA”). Preparar 0,75 mL de solución A en un tubo de centrífuga de 1.5 mL diluyendo 75 μL de la solución de óvulos con 0,675 mL de DMSO para generar una solución de 5 mg/mL de óvulos en DMSO que contiene 10% de agua por volumen. Mezclar bien y centrifugar brevemente como se describió anteriormente.Nota: Véase el paso 2.1.6 en relación con efectos de agua. Como en secciones anteriores, se pueden escalar los volúmenes de solución arriba o abajo ajuste necesidades materiales. Preparar la solución B disolviendo el estabilizador de copolímero de bloque (es decir, poly(styrene) -b- poli (ácido acrílico), PS5 k-b- PAAk 4,8) en DMSO a 6 mg/mL. Mezcla bien y someter a ultrasonidos para disolver si es necesario. Pipetee 0,75 mL en un tubo de centrífuga de 1.5 mL. Pipeta de 0,75 mL de THF (solución C) en un tubo de centrífuga de 1.5 mL. Pipetee 1,85 mL de cloroformo (solución D) en un vial de centelleo de vidrio. Preparar un 60,0 mg/mL de cloruro de calcio dihidrato crosslinker solución en metanol. Mezclar con un mezclador de tipo vórtex. Preparar un 4,17 mg/mL solución de amoníaco en metanol como se describe en el paso 2.3.4. Añadir 5,25 mL de cloroformo a un tubo de centrífuga de 15 mL como el baño de Temple. Preparar el montaje de la mezcladora y soporte. Se reúnen al receptor inferior, geometría de disco, el disco superior, la llave y una junta tórica de la mezcla. Vea la figura 2 para el esquema de componentes y la terminología de soporte de mezclador.Nota: Detalles de construcción MIVM pueden encontrarse Información adicional (sección 1) y en la literatura22. Archivos CAD están disponibles como Información complementaria . Coloque el aro tórico en la ranura, asegurándose que esté bien y que no hay ninguna señal de desgaste o daño.Nota: El funcionamiento Normal dará lugar a anillos desgastados o hinchados por el solvente. Si el anillo aparece estirada o deformada, déjelo al aire seco durante la noche antes de su uso. Si la forma no se recupera durante la noche, deseche la junta tórica. Mantener un amplio stock, ya que es una pieza consumible. Cuidadosamente Alinee los orificios de disco mezclado con las clavijas en el disco superior y empujar juntos. Asegúrese de que la junta tórica no desplazarse marcando que las dos piezas sentarse a ras. Invertir las dos piezas y montarlos manualmente con el receptor de la parte inferior. Asegúrese de que la salida la tubería se haya aflojado para que no interfiera con el ajuste completo del disco.Nota: Si las Roscadoras capturas durante el montaje, desmontar cuidadosamente y aplica un grado alimenticio o farmacéutico anti-agarrar a la rosca para evitar daños en las roscas. Después de apretar manual, ajuste la llave a las clavijas de disco superior y apriete firmemente el conjunto. Apriete la conexión de la tubería de salida modo que quede asentada firmemente contra la cara inferior de la geometría de la mezcla. Asegúrese de que las guarniciones de la jeringa en el disco superior estén bien ajustadas. Coloque el mezclador montado en el soporte de mezclador para que el tubo de salida se extiende por debajo de la placa de soporte. Apoyar la placa móvil para que esté suspendida fuera del camino el espacio de trabajo. Opcionalmente revisar la alineación de tope mecánico, primero sujete el vaso vacío jeringas a las entradas del mezclador.Nota: Caudal volumétrico es variados usando jeringas de barril diferentes diámetros, ya que las jeringas están deprimidas simultáneamente a la misma velocidad lineal. La altura vertical inicial y final debe ser el mismo para todas las jeringas y puede ajustarse utilizando los tornillos roscados en el émbolo del eje22. Los topes mecánicos aseguran que no ocurra daño excesivo a las jeringas de vidrio. Opcionalmente, baje la placa móvil por lo es viene a descansar en los topes mecánicos. Asegurar que éstos estén alineados para que la placa también viene a descansar inmediatamente antes de ponerse en contacto con las jeringas vacías (como se ve en la figura 2). Opcionalmente, aflojar los topes mecánicos y reposición, si es necesario. Retire las jeringas de vidrio y reset de la placa móvil.Nota: Para la operación con jeringas de plástico, los topes mecánicos no son necesarios. Coloque el baño de Temple abierto debajo de la tubería de salida para recoger el efluente. Dibujar la solución A en una jeringa de 1 mL estanqueidad utilizando una aguja de punta Roma. Eliminar todas las burbujas de aire y tire de la aguja. Preparar la solución con el fin de la conexión de luer de la jeringa. Repita este proceso para las soluciones B y C. Llamar D solución en una jeringa de 2.5 mL estanqueidad utilizando una aguja de punta Roma. Eliminar todas las burbujas de aire y tire de la aguja. Preparar la solución con el fin de la conexión de luer de la jeringa.Nota: Estos volúmenes han sido seleccionados para que las alturas de émbolo de jeringa inicial son los mismos. Si se cambian los volúmenes, todavía debe cumplen con este requisito de altura. Armar las cuatro jeringuillas en el mezclador de manera derecha en orden alfabético. Ver figura 1B para jeringa orientación esquemática y aspecto final.Nota: Compruebe que no hay altura de jeringa es significativamente diferente de los demás y resolver problemas según sea necesario. Realizar limpieza y operación de la mezcladora. Sujete el soporte a ambos lados de la placa móvil. No coloque los dedos en la cara inferior de la carcasa porque es un peligro de pellizco en los topes mecánicos. Lentamente baje la placa móvil para que se apoye uniformemente pero apenas tocarla las jeringas. Constantemente y suavemente presione la placa, con el objetivo de completar la operación en alrededor de 0.5-1 s para estos transmitir volúmenes22. Quitar y cerrar el tubo de baño de Temple que ahora contiene la dispersión de la NP. Lleve la batidora con las jeringas fijadas y más de un contenedor de residuos. Retire las jeringas, permitiendo que el volumen de retención vaciar en el recipiente. Sujete el ensamble de mezclador al revés y desmontar la batidora usando la llave. Usando un atomizador, enjuague el tubo de salida con varios mililitros de solvente (por ejemplo, acetona) y secar con aire o nitrógeno. Enjuague la mezcla geometría con un buen solvente (por ejemplo, desionizada agua o DMSO) y luego enjuague con acetona con varios mililitros de una botella de spray. Seca con un chorro de aire o nitrógeno. Enjuague la junta tórica en una corriente de agua desionizada y seque. Enjuague el disco superior con varios mililitros de acetona con una botella de solvente hasta que visualmente limpio. Seque con un chorro de aire o nitrógeno la superficie y las conexiones de la jeringa. Enjuague cada jeringa con varios mililitros de un buen disolvente (por ejemplo, desionizada agua o acetona) de una botella de solvente. Aplicar un enjuague final de varios mililitros de acetona y aire seco antes de usarlo. Realizar análisis y procesamiento posterior. Añadir 50 μL de cloruro de calcio dihidrato crosslinker solución gota a gota mientras revuelve alrededor del 75% velocidad máxima. Añadir 50 μL de la solución de amoniaco gota a gota, removiendo a la velocidad máxima de 75%. Edad de por lo menos 30 minutos. Se caracteriza por el tamaño de NP como se describe en los pasos 2.3.1 y 2.3.2. Proceso de la dispersión de NP para producir micropartículas o NPs cubiertos como se describe en la literatura19,20,21. 4. modificaciones de formulación escalar Preparar las soluciones solvente y antisolvent como se describe en los pasos 1, 2 o 3 en la composición deseada y en volumen suficiente para el tamaño de la formulación requerida. Opcionalmente, si es necesario, limpie y esterilice el mezclador utilizando un protocolo adecuado antes de la formación de la NP.Nota: Alternativamente enjuagues de CIP 100, agua (pH neutro), CIP 200, agua (pH neutro) y un solvente adecuado han sido empleados en el pasado. Además, pueden acoplarse filtros estériles a las entradas de la mezcladora en casos donde el tamaño de partícula final impide la esterilización por filtración. Las soluciones de carga en jeringas gas tight de volumen adecuado y fije el tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) con un adaptador luer en el extremo. Ceba manualmente las soluciones al final de la tubería. Cargar las jeringas en una bomba de jeringa y coloque las jeringas a las entradas del mezclador en el CIJ o MIVM, según sea necesario.Nota: Alternativamente, controladores de flujo pueden utilizarse en el laboratorio o a escala piloto para proporcionar capacidades de volumen más grandes que una bomba de jeringa. Operación exitosa requiere de constante flujo y caída de presión suficiente, lo que significa que los recipientes a presión con medición de flujo en la salida de la selección más apropiada para la producción a gran escala. Coloque un recipiente de colección que contiene un baño de Temple de volumen suficiente, si es necesario, debajo de la tubería de salida. Establecer las tasas de flujo volumétrico para que coincidan con los obtenidos manualmente (por ejemplo, cerca de 30-60 mL/min por corriente).Nota: Si utiliza el CIJ, el caudal de la bomba debe ser idéntico. Si utiliza el MIVM, entradas diferentes pueden tener diferentes caudales. Al mismo tiempo comienzan las bombas. Recoger unos 5-10 mL de efluentes como residuos en un frasco pequeño (esto es un “volumen de Start-up”) y luego comenzar a colectar en el baño de Temple. Caracterización y proceso como se describe en la sección correspondiente de la formulación anterior.

Representative Results

Selección de formulaciones de NP con FNP es rápido y requiere pequeñas cantidades de material (del orden de 1-10 mg). El protocolo FNP para encapsular compuestos hidrofóbicos tales como vitamina E (paso 1) resulta en una dispersión de NP estable, transparente o ligeramente opalescente. Dispersión ligera dinámica (DLS) proporciona un medio sólido para caracterizar el tamaño de partícula. Como se muestra en la figura 3, el proceso produce NPs con un baja polidispersidad de manera reproducible. El índice de polidispersidad típica (PDI) es inferior a 0.20, indicando un relativamente monodispersa población. El PDI se obtiene de la función de autocorrelación y a menudo es implementado en el software del instrumento. Es una relación de la segunda para el primer momento, donde generalmente se obtienen valores de 0.1 monodispersa partículas26. Para los cuatro vitamina E/PS-b-PEG formulación repeticiones registrados, el valor fue de 0.12 ± 0,02 y el diámetro promedio fue de 107 ± 7 nm. Un típico “fallar” debido a cualquier depresión irregular de las jeringas o velocidad más lenta de la depresión también se divulga en la figura 3. La polidispersidad fue afectada, pero el tamaño era un poco más grande (135 nm). Incluyendo en este ejemplo, las nuevas métricas de tamaño de partícula son 113 ± 14 nm. Un fallo de encendido resultados en periodos de tiempo donde la cámara contiene sólo un tipo de secuencia única. Es importante que la secuencia entera experimenta la misma historia proceso y volúmenes relativos de las corrientes acuosas y orgánicas dentro de la mezcladora. Sin un estabilizador, se produce una solución opaca con agregados visibles. La función de autocorrelación DLS para esta muestra es no monotónica y no decaiga suavemente, como se ve en el recuadro de la figura 3 . Control de tamaño de partícula por FNP se demuestra en la figura 4, donde varían las cantidades relativas de material de la base – poly(styrene)1,8 k en este caso – y PS -b-PEG estabilizador dio lugar a tamaños de partículas que oscilan entre 49-152 nm. Estos tamaños de partícula se generaron con arroyos THF que contiene una concentración de masa total del núcleo y estabilizador de 20 mg/mL, donde el 25%, 50% o 75% de la masa fue el material de la base de poly(styrene). La polidispersidad de las nanopartículas ha sido siempre inferior a 0.15. Discusión extensa de los efectos de parámetro de tamaño de partícula producida por FNP puede encontrarse en la literatura10. La carga puede ajustarse manteniendo la constante de volumen de solvente y variando los volúmenes relativos de las soluciones stock base y estabilizador. Del mismo modo, la concentración en masa total puede variar mediante la preparación de soluciones madre en valores distintos de 10 mg/mL. Bajo ciertas condiciones, es posible observar una población de micela vacía por DLS27. Esto no tiene ningún efecto perjudicial aparte de ampliar la distribución de tamaño de partícula medido. Cuando los tamaños son similares, esto puede manifestar como un solo pico amplio en lugar de dos picos separados. El mismo mezclador CIJ también puede utilizarse para encapsular compuestos hidrófilos por iFNP, como en el paso 2 del protocolo. Las partículas producidas en la formulación divulgada son alrededor de 65 nm con una baja polidispersidad de 0.08. La distribución puede verse en la figura 5A (líneas discontinuas). El efecto de la reticulación los residuos de ácido carboxílico de la PAA en la estabilidad de la partícula es demostrado por análisis DLS en un solvente fuerte como DMSO, como se muestra en la figura 5B. La función de autocorrelación para las partículas bien reticulado debe empezar cerca de un valor de 1 y bruscamente a 0 en un momento característico que se relaciona con el tamaño de partícula (línea sólida). Partículas que se hinchan extensivamente o disolverán no reticulado y muestran autocorrelación mínima señal (línea punteada). Para iFNP, ensayos fallidos manifiestan de manera similar como se describe arriba de FNP. Pueden observarse agregados visibles o se puede observar la forma de la función de autocorrelación de pobre DLS. El MIVM puede utilizarse para la FNP o iFNP cuando más de dos corrientes de entrada son necesarios debido a las limitaciones del sistema como la solubilidad o incompatibilidad química. Una versión en pequeña escala de la MIVM (μMIVM) con un stand mixer se muestra en la figura 2. Como con el CIJ, este mezclador puede utilizarse para encapsular compuestos hidrofóbicos o hidrofílicos22. En el paso 3, se describe un protocolo de encapsulación de una proteína hidrofílica, OVA, por iFNP. La distribución de tamaño de partículas se muestra en la figura 5A (línea sólida). El tamaño es de alrededor de 125 nm con una PDI de 0,16. Un protocolo general de funcionamiento de la bomba de jeringa en escalas más grandes se proporciona en el paso 4. Figura 1: montaje del mezclador y flujo interno patrón esquemas. Mezclador de jets (CIJ) (A) los confinados que inciden con jeringas adjuntadas se coloca sobre el baño de Temple. En la foto no son una barra de agitación en el frasco de baño de Temple y una placa de agitación. La geometría de mezcla se representa en la vista ampliada que muestra las entradas de corriente de dos que inciden en el centro de la cámara. (B) una multi-entrada vórtex (μMIVM) se muestra con jeringas de vidrio y se coloca en el soporte por encima de un baño de Temple. La placa móvil y los topes mecánicos han sido recortados de la imagen. La vista ampliada muestra el compartimiento del vórtice y los canales de entrada esquemáticamente. (C) A representación esquemática de NPs de core-shell de FNP. Esferas rojas representan la terapéutica que, combinado con el bloque de polímero contraído azul, conforman el núcleo de la NP. El bloque de polímero amarillo forma la capa de pincel impartir estabilización estérica de los NPs. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: μMIVM terminología y componentes para el montaje. Lo μMIVM requiere un soporte de mezclador para depresión uniforme de las cuatro jeringuillas. En este caso, las alturas de émbolo de la jeringa deben todos ser uniformes para asegurar una mezcla consistente. Como alternativa puede utilizarse con bombas de jeringa. El soporte de mezclador con marcados componentes se muestra a la izquierda de la figura. A la derecha es el mezclador desmontado con la junta tórica en el lugar en el disco mezcla de geometría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Partícula tamaño de distribución de nanopartículas poliméricas que contiene una base de vitamina E y estabilizado por PS -b-PEG. Dispersión ligera dinámica (DLS) provee distribuciones de tamaño intensidad ponderada que indican la distribución de diámetro de NP. Curvas son el promedio de los análisis por triplicado para cada ensayo y han sido escalarlos disminuir para producir alturas de pico máximo idéntico. Las cuatro repeticiones (líneas sólidas) indican la alta reproducibilidad del método (desviación estándar = 7 nm). También es una falla representativa (línea discontinua), como la velocidad más lenta de la jeringa o depresión irregular de dos jeringas, que se traduce en mayor diámetro de la partícula. La desviación estándar del tamaño NP incluyendo la falla fue de 14 nm. (Recuadro) Sin el PS -b-estabilizador de PEG, se forman grandes agregados escala del micrón (o gotas, en el caso de un aceite como vitamina E). La función de autocorrelación DLS de un funcionamiento sin el estabilizador (línea punteada) se muestra junto con un representante de autocorrelación de una repetición de nanopartículas (línea sólida). La función de autocorrelación muestra un número de escalas de tiempo característico para la muestra control, lo que indica una población de polidispersas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: control de tamaño de partícula por FNP a través de diferentes ratios relativos de base material estabilizador. Las distribuciones de tamaño intensidad ponderada de tres formulaciones con un núcleo de poly(styrene) estabilizaron por PS -b-PEG son representados. La concentración de masa total en THF fue de 20 mg/mL y el antisolvent era agua. Las formulaciones fueron elaboradas en un mezclador CIJ. La fracción de la masa compuesta del material del núcleo se encuentra en la leyenda. Por ejemplo, la muestra del 25% de la base contenía 5 mg/mL poly(styrene) y 15 mg/mL PS -b-PEG. Los tamaños promedio de 25% (línea sólida), 50% (línea punteada) y 75% (línea de tablero mixto) cargamentos de base fueron 49 nm, 96 nm y 152 nm, respectivamente. Todos los valores de PDI fueron menos de 0.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: caracterización de NPs invertidos en un CIJ mezclador o μMIVM. Curvas de (A) DLS son el promedio de los análisis por triplicado para cada formulación. La línea discontinua indica la distribución de tamaño de 3 partículas de MD de k hechas en el mezclador de la CIJ, mientras que la línea continua es la distribución de tamaño de partículas de OVA en el μMIVM. (B) la fuerza de reticulación puede evaluarse DLS utilizando DMSO como el diluyente. La función de autocorrelación DLS indica la fuerza de la reticulación a través del valor inicial de la autocorrelación y la observación de una transición limpia a un valor de cero. La línea discontinua representa la función de autocorrelación para una partícula con no crosslinker mostrando una débil señal inicial y un tiempo de gran decaimiento. La línea sólida representa la autocorrelación después de la adición de una fuerte crosslinker (en este caso, tetraethylenepentamine), que muestra una señal inicial fuerte y un calendario definido de decaimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: sobresaturación, S, en función de los cocientes de mezcla relativa de solvente orgánico agua. (A) comparación de sobresaturación más alto alcanzable para el péptido de boscalid, pesticida y (■) (○) B, un péptido de siete residuos modelo. La corriente orgánica contiene boscalid en una concentración de 230 mg/mL y el péptido B 200 mg/ml, su concentración de saturación. Hay una sobresaturación máximo que depende de cada ingrediente farmacéutico activo (API) / solvente sistema. (B) al disminuir la concentración de boscalid en la corriente orgánica 20-fold, las condiciones en que se logran sobresaturación y nanoprecipitation ser limitadas. Esta figura es reimpreso con autorización de Elsevier9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La encapsulación de compuestos hidrofóbicos tales como vitamina E, como en el paso 1 del Protocolo, ha sido ampliamente descrito9,14,28. Relativamente monodispersa partículas se producen porque la escala de tiempo para mezclarse es más corta que la escala de tiempo para la agregación y crecimiento de las partículas. Específicamente, la solución de solvente/antisolvent mezclada rápidamente se convierte en homogénea, que permite nucleación ocurra uniformemente. Asamblea del copolímero en bloque a la superficie de la partícula entonces proporciona estabilización estérica que detiene el crecimiento de partículas5. Tiempo de mezcla en la cámara (turbulencia) es una función de los caudales de entrada al CIJ o el MIVM, hay una tasa de entrada, que ocurre después de la transición a la mezcla turbulenta, donde el tamaño de partícula es esencialmente constante13. Esto proporciona robustez adicional al proceso como algunos lote de a variación en el caudal de entrada (es decir, la jeringa depresión velocidad) puede ser tolerada sin impacto significativo en el tamaño final de NP como se ve en la figura 3. Velocidades de entrada lenta o irregular pueden resultar en partículas más grandes o más distribuciones polidispersas, como se ve en el ejemplo de fallo de encendido. FNP se ha extendido también para encapsular compuestos hidrófilos en nanopartículas por inversa NanoPrecipitation Flash. Estos invierten nanopartículas pueden luego utilizados para crear micropartículas o recubrir con PEG para crear nanopartículas agua dispersible25. Los principios subyacentes de la Asamblea siguen siendo los mismos, aunque la complejidad añadida de la reticulación es el núcleo de la partícula. Esto es necesario para la estabilización de la partícula en un ambiente acuoso. En general, una proporción de 1:1 carga comparada con el bloque polyacid es suficiente, aunque las interacciones iónicas pueden ser promovidas por el ajuste de pH mediante la adición de una base19. En este protocolo, se ha descrito sólo el primer paso del proceso para NPs de forma invertida.

Además de mezcla rápida, exitosa formulación de FNP o iFNP se limita a casos en donde varias condiciones pueden ser resueltos9,14. En primer lugar, todo flujo de insumos debe ser miscible. Mientras que las emulsiones se han utilizado para producir NPs, FNP requiere una fase de solución uniforme en el mezclador. En segundo lugar, el componente de la base debe ser casi insoluble en las condiciones del solvente en el mezclador (del CIJ, un mezcla 50/50 en volumen) impulsión rápida nucleación. De lo contrario, una porción significativa seguirá siendo unencapsulated o precipita después de la dilusión adicional con antisolvent. El MIVM permite mayor antisolvent contenido en la cámara de mezcla para limitaciones de solubilidad del material de núcleo de dirección. A menudo es útil generar curvas de sobresaturación de datos de solubilidad en función de la composición solvente para guiar el proceso de diseño9. La figura 6 muestra las curvas representativas de dos compuestos. Baja sobresaturación en los méritos de condiciones cámara mezcla en diferentes composiciones, normalmente utilizando el MIVM. Mayor sobresaturación favorece la nucleación de la componente de la base sobre el crecimiento de partículas sino un desajuste en el tiempo de montaje del material del núcleo y el estabilizador puede resultar en grandes agregados de la terapéutica. Addio y Prud’homme han examinado la aplicación de tales curvas de sobresaturación en detalle9. Finalmente, el BCP debe disolverse molecularmente en el flujo de solvente y la secuencia antisolvent debe ser selectiva para una cuadra. El BCP debe ser suficientemente anfifílicos para proporcionar ambos solvophobic motor del bloque derrumbado para anclar el estabilizador en la superficie de la partícula y para el bloque de solvated impartir estabilidad estérica de la partícula. Disolventes que no sean los descritos en el protocolo pueden utilizarse siempre y cuando cumplan estas restricciones.

Práctica con la operación de jeringa manual puede mejorar la tasa de éxito durante la proyección. Como se señaló anteriormente, la operación por encima de la transición a condiciones de mezcla turbulenta homogéneas significa que pequeñas variaciones en caudal son toleradas en el proceso28. Escala-hasta resultados de flujos de bomba-conducido, controlado por ordenador en incluso mayores aumentos en la consistencia debido a los caudales de entrada reproducible. En cualquier punto durante el procesamiento posterior de las partículas, inspección visual o análisis DLS pueden indicar la presencia de grandes agregados que puede ser debido a la inestabilidad de polvo o partículas incidental. Cuando sea necesario, se puede filtrar la corriente con un tamaño de poro del filtro apropiado. En la ausencia de agregados, hemos encontrado que menos de 5% masa es típicamente perdida cuando las nanopartículas recubiertas de PEG de filtración si el tamaño de filtro nominal es mayor que la distribución de tamaño de partícula. Filtrado de agregados, determinación experimental de la masa perdida durante el proceso es necesario. Cuantificación de la pérdida de masa puede efectuarse de dos maneras. La masa total de sólidos en un volumen dado se puede determinar por análisis termogravimétrico antes y después de la filtración para identificar la magnitud del cambio (ver apartado Información adicional 2). Por otra parte, las partículas pueden ser recuperados (por ejemplo, por liofilización) y disuelven en un solvente de buena. La concentración de material de la base entonces se puede medirse directamente por una técnica apropiada como espectrofotometría de ultravioleta-visible o cromatografía.

Para FNP, residual 10 vol % solvente orgánico (e.g., THF) debe eliminarse de la dispersión acuosa. Esto puede hacerse por destilación por evaporación14,29, diálisis30o de31,de filtración de flujo tangencial32. Consideraciones prácticas para cada paso del proceso se describen en las citas proporcionadas. Para diálisis, membranas típicas son kDa 3,5 o 6-8 kDa atajos, aunque hay más opciones. Este corte de peso molecular es suficiente para la eliminación de solventes cuando se dializaron durante 24 h con varios cambios de baño. El uso de la filtración de flujo tangencial implica un proceso de desarrollo debe tener cuidado para evitar inducir la agregación debido a la polarización de la concentración en la superficie de la membrana. Hemos encontrado que reduce la composición solvente orgánica debajo de un valor dependiente del sistema, generalmente 2-10 vol %, elimina la agregación en la superficie de la membrana. Después de un tratamiento, la concentración de nanopartículas se determina fácilmente por análisis termogravimétrico (ver apartado Información adicional 2). A menudo es conveniente transportar o almacenar las partículas en una forma muy estable. Dispersiones acuosas pueden simplemente ser congelados rápidamente a través de una mezcla de hielo seco/acetona y luego almacenadas a-80 ° C. Por otra parte, polvos secos se pueden obtener por liofilización33,34 o aerosol secado24. Con frecuencia, debe agregarse un crioprotector para reducir la agregación de nanopartículas durante la congelación o secado. Azúcares (sacarosa, trehalosa, etc.), poly(ethylene glycol) o ciclodextrinas pueden ser defendidos para eficacia en un rango de concentraciones mediante el control de tamaño por DLS35,36,37, 38. Problemas de NP estabilidad durante el proceso suelen relacionarse con la solubilidad o fase de separación en la base, dando por resultado la cambio hacia un estado de energía más bajo condiciones donde se aumenta la movilidad. Uso de materiales de la base Co, estabilizadores alternativos o composición de la solución externa modificada puede ayudar a mejorar la estabilidad14,16,17,39,40, 41.

Como se señaló anteriormente, el MIVM permite mayor antisolvent contenido en la cámara de mezcla cuando se requiere lograr alta sobresaturación. También puede permitir la segregación física de especies en más de dos cursos cuando limitaciones de reactividad o solubilidad lo exigen. Un ejemplo es la formación de nanopartículas de estabilizada por la proteína zein del clofazimine antibiótico24. La clofazimina hidrofóbico se introduce en una corriente de acetona; Zein se introduce en una corriente acuosa etanol 60%; caseína, que complejos con zein, es presentada con un flujo tampón acuoso, y la cuarta secuencia es amortiguación adicional para aumentar la proporción de agua en acetona y etanol. Dos flujos de solvente se requieren puesto que no son solubles en un solvente común clofazimina y zein. Este proceso no podría ser realizado en un mezclador CIJ dos jet. Esta formulación estabilizada de proteína también demuestra que la FNP no se limita a estabilizadores BCP. Las partículas Janus han sido producidas sin estabilizador42 y han demostrado una amplia gama de estabilizadores de bajo costo para aplicaciones orales24. En particular, copolímeros como hidroxipropil metilcelulosa pueden utilizarse en lugar de copolímeros de bloque24. Materiales de la base pueden hacerse más hidrofóbicos por un número de técnicas. Emparejamiento iónico hidrofóbico se ha aplicado para encapsular una gran variedad de compuestos que tienen solubilidad intermedia43,44,45. Han sido extremadamente hidrofóbicas prodrugs generado y luego encapsulado46. Los ácidos nucleicos han sido encapsulados a través de la formación de complejos con lípidos catiónicos47. Lo importante, estos estudios han demostrado que la FNP puede producir una gama de la química superficial de la partícula. Se han utilizado estabilizadores más, mezclados con una fracción del BCP que ha sido modificado con un ligando targeting en el extremo de la cadena. Esto permite un control preciso sobre el contenido del ligando en la superficie ya que la composición de la partícula refleja la secuencia de entrada composición23,48. Del mismo modo, es posible incorporar múltiples componentes de la base, incluyendo tintes y nanopartículas inorgánicas3,8.

NanoPrecipitation Flash es un enfoque escalable a nanopartículas poliméricas de una hidrofóbica o un núcleo hidrofílico. Si se cumplen los criterios enumerados anteriormente, generalmente más 95% del material del núcleo está encapsulado en alta fracción de masa de la partícula. Los tres ejemplos presentados aquí se llevaron a cabo a escala de banco, que requieren unos pocos miligramos de material y unos 0,5 mL en cada flujo de entrada. Esto permite para la detección rápida de las condiciones de partículas para la optimización de la formulación. Escala de formulaciones de plomo para tamaños de hornada más grandes es cuestión de ejecutar el proceso para más de largo, que fácilmente puede ser logrado mediante el uso de bombas de jeringa o controladores de flujo. Por el contrario, el escalado de nanoprecipitation además de a granel retos bien documentado para mantener suficiente micromixing en el punto de adición y representa el efecto de cambiar la geometría de buque49. Este es un gran obstáculo, ya que es crucial para la fabricación de partículas de forma constante para cumplir con los requisitos de FDA50. Técnicas de microfluídica pueden también producir nanopartículas uniformes, reproducibles, pero sólo permiten la producción en el rango de miligramos. Por ejemplo, Karnik et al informaron tasas de producción de 0.25 mg/min para una liberación del fármaco de estudio51. Otra escala-para arriba implica típicamente paralelización en capital alto costo12. Con FNP, es sencillo producir 1 gramo de nanopartículas a 600 mg/min con una bomba de jeringa y unos accesorios para la conexión a las entradas del mezclador. En consecuencia, FNP representa una herramienta de proyección de escala de laboratorio accesible así como un enfoque escalable a la producción de NP para trabajo traslacional.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por fondos de Optimeos Ciencias de la vida, la National Science Foundation (CBET 1605816), el proyecto de ley, Fundación Gates (BMGF, OPP1150755) y el nacional ciencia Fundación graduados beca de investigación (DGE-1656466) a K.D.R.

Materials

Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting – CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule – CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing – CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting – MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing – MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17
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Referências

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Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).
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