式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製
Summary
このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル グリッドとスクリーニングと同様、データ収集と処理。
Abstract
正規の TRP 亜科の一過性受容体電位チャンネル (TRPCs) が重要な役割を果たすカルシウム恒常性、特にストア作動性カルシウム エントリの適切な機能を維持するために不可欠な非選択的陽イオン チャネルシナプス小胞の放出と細胞内シグナリング。したがって、TRPC チャネルは、さまざまな心臓肥大などの心臓血管疾患、パーキンソン病などの神経変性疾患、脊髄小脳変性症などの神経系の疾患を含む人間の病気に関与しています。したがって、TRPC チャネルは、人間の病気の潜在的な薬理学的ターゲットを表します。ただし、これらのチャネルのゲーティングの分子メカニズムはまだ明らかではありません。安定性、均一な精製されたタンパク質の大量の取得の難しさ構造決定研究、特に TRPC イオン チャネルなどの哺乳類の膜タンパク質の制限要因となっています。ここでは、親和性とサイズ排除クロマトグラフィーによって変更されたバキュロ ウイルス遺伝子の転送システムとこれらの蛋白質の精製を用いた哺乳類のイオン チャンネル膜タンパク質の大量発現のためのプロトコルを提案する.さらに浄化された蛋白質から単一粒子の低温電子顕微鏡画像を収集するために、これらの画像を使用して蛋白質の構造を確認するプロトコルを提案します。構造決定は、ゲートとイオン チャネル機能のメカニズムを理解するための強力な方法です。
Introduction
カルシウムは、ホルモン分子合成1,2,3伝達物質の放出、転写制御カスケードのシグナリングを含むほとんどの携帯電話のプロセスに関与しています。細胞内の自由なカルシウムの恒常性の維持は健康と細胞の機能に不可欠です。ストア作動性カルシウム エントリ (SOCE) カルシウムの枯渇に格納する小胞体 (ER) トリガー イオン チャンネルの開口部を容易にする膜のプロセスは、細胞内のカルシウムの恒常性の主要なメカニズムの 1 つ、さらに4,5,6のシグナル伝達に使用できます、小胞体カルシウムの補充。TRP スーパーファミリーに属するカルシウム透過チャネルである、潜在的な一過性受容体チャンネル (TRPCs) は、SOCE7,8,9の主要な参加者として識別されています。
TRPC 家族の 7 人のメンバーの間で TRPC3、TRPC6、および TRPC7 ホモログ サブグループを形成し、脂質二次メッセンジャー ジアシルグリセ ロール (DAG) シグナル伝達脂質の分解物によって活性化することで一意ホスファチジルイノシトール 4, 5-二リン酸 (PIP2)10,11。TRPC3 は、平滑筋と神経伝達と神経新生12,13に影響を与えるカルシウム シグナル伝達に重要な役割を果たしている脳の大脳と小脳の地域に強く表されます。TRPC3 の機能不全は、中枢神経系疾患、心血管疾患、卵巣腺癌14,,1516など特定の癌にリンクされています。したがって、TRPC3 は、これらの疾患の治療のための医薬品のターゲットとしての約束を保持しています。TRPC3 作用する特化した医薬品の開発は、脂質結合サイト17,18を含むその分子活性メカニズムの理解の欠如によって制限されており。我々 はこれらのメカニズムの19に重要な洞察を提供する人間 TRPC3 チャネル (hTRPC3) と閉じた状態その 2 つの脂質結合部位の最初の原子分解能の構造を報告しています。
高解像度での膜タンパク質の構造決定の重要な要因は、高品質の蛋白質を得ることです。高品質の蛋白質を得るに必要な発現と精製条件の対応するスクリーニングは、時間がかかり、高価な努力をすることができます。ここで表現と hTRPC3 は、私たちの最初のスクリーニングで不完全の浄化のための最適の条件を識別する方法を詳しく説明するプロトコルを提案する.トラブルシューティングおよび電顕 (Cryoem) 私たちの低温電子の固体基盤を築くタンパク質の動作を最適化する方法でいくつかの重要なポイントを紹介します。生成するベクトル (pEG) Gouaux と同僚が開発したスクリーニング アッセイおよび哺乳類細胞20でバキュロ ウイルスの効率的な生成のために最適化されている変更された baculoviral を使用します。この表現方法は哺乳類の細胞膜のタンパク質の発現を迅速かつコスト効果の高い適切です。ベクトルの使用この蛍光検出のサイズ排除クロマトグラフィー ベースと (FSEC) 法21の細胞診を組み合わせています。このメソッドは、興味の構造を融合した緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグを使用して、小さな、細胞可溶化されたサンプルのターゲット蛋白質の可視化を向上させます。これは異なる洗剤や添加物、thermostabilizing の突然変異で、タンパク質の安定性のスクリーニングにより、小規模なトランスフェクション細胞の数が少ないを使用できます。このように、条件の多くを急速に大規模な蛋白質の浄化に移動する前に検査します。次の式、スクリーニング、および浄化を取得し、タンパク質のde novoの構造決定を生成する低温電子顕微鏡から画像を処理するためのプロトコルを提案する.ここで説明したアプローチ、TRP チャネル受容体および他の膜タンパク質の構造研究のための汎化可能なプロトコルとなることと考えています。
Protocol
1. DH10α バクミド DNA を生成する有能なセルの変形 興味の遺伝子を合成し、N 末端 (pFastBacI)20トロンビン胸の谷間サイトとツインの連鎖球菌性タグ、His8-タグ、および GFP を含むペグ ベクトルの修正バージョンに subclone。 5 を追加して有能なセルを変換 DH10α 1.5 ml チューブし、氷で 10 分間インキュベートの 50 μ L を pFastBacI で目的遺伝子を含むプラスミドの ng。?…
Representative Results
表現のプロトコルの概要と hTRPC3 の精製は、図 1 aに表示されます。理想的な白人植民地、バクミド DNA 精製のために選択のような hTRPC3 バクミド板のイメージは図 1 bに表示されます。わかったその 48 h は明確な黄色 gal は、隔離されたコロニーの存在を維持しながらの染色に最適です。P2 hTRPC3 GFP 蛍光で可視化としてのウイ?…
Discussion
低温電子顕微鏡による蛋白質の構造決定はしない蛋白質の構造決定を大きく短縮新しいカメラやアルゴリズムの開発のおかげで、過去数年間で構造生物学の分野に革命をもたらしました容易に、特に膜タンパク質結晶化します。すべての低温電子顕微鏡技術の最近の進歩にもかかわらず、高画質頻繁化を容易にするために十分な質と量で浄化された蛋白質の準備の時間がかかり、高コスト、?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
デビッドのヴァン アンデル高度なクライオ電子顕微鏡スイートでデータ収集をサポート、G. 趙と X. 孟に感謝します。バリ ハイ パフォーマンス コンピューティング チーム計算サポートのお願い申し上げます。我々 はこの原稿を大幅改善コメント (名) ・ クレメンテ、D. 会費、j. Floramo、雄黄、Y のキム c. ミューラー、B. Roth、Z. ルアンに感謝の意を与えます。D. Nadziejka は、この原稿の編集サポートを感謝いたします。この仕事は、内部のバリによって支えられた資金。
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
Referências
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Citar este artigo
Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).