Bruke forbedret grønne fluorescens Protein-uttrykke Escherichia Coli å vurdere musen Peritoneal Macrophage fagocytose
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere musen peritoneal macrophage fagocytose med forbedret grønne fluorescens protein-uttrykke Escherichia coli.
Abstract
Dette manuskriptet beskriver en enkel og reproduserbar metode for å utføre en fagocytose analysen. Den første delen av denne metoden innebærer å bygge en pET-SUMO-EGFP vektor (SUMO = liten ubiquitin-lignende modifikator) og uttrykke forbedret grønne fluorescens protein (EGFP) i Escherichia coli (BL21DE). EGFP-uttrykke E. coli er coincubated med makrofager 1t på 37 ° C; negativ kontrollgruppen er ruges på is for samme mengde tid. Så er makrofagene klar for vurdering. Fordelene med denne teknikken inkluderer enkel og grei trinnene og fagocytose kan måles ved begge flyt cytometer og fluorescens mikroskop. EGFP-uttrykke E. coli er stabile og viser en sterk fluorescens signalet selv etter makrofagene er løst med paraformaldehyde. Denne metoden er ikke bare egnet for vurdering av macrophage linjer eller primære makrofager i vitro men også egnet for vurdering av granulocytt og monocytt fagocytose i perifert blod mononukleære celler. Resultatene viser at phagocytic evnen til peritoneal makrofager fra unge (åtte uke gamle) mus er høyere enn makrofager fra alderen (16-måned gamle) mus. I sammendraget, denne metoden måler macrophage fagocytose og er egnet for å studere funksjonen medfødte immunsystemet.
Introduction
Macrophage fagocytose analyser brukes ofte til å studere medfødte immunforsvar. Medfødte immunforsvaret kan indikere mottakelighet for infeksjon. Macrophage linjer er mye brukt i immunologi studier. Men lengre passasje kan forårsake genet tap og svekket immunforsvar funksjoner i disse linjer. Dermed er de primære peritoneal makrofagene ideelle objektet i å studere celle funksjon1.
Selv om medfødte immunforsvaret var tenkt å være intakt i alderen kroppen, kan phagocytic evnen redusere forhold til at i yngre kroppen2,3. Her viser vi en metode for å vurdere fagocytose av peritoneal makrofager fra young (åtte uke gamle) og alderen (16-måned gamle) mus ved hjelp av EGFP-uttrykke E. colisom er praktisk, rask og økonomisk gjennomførbart.
Bruk av en EGFP-uttrykke E. coli belastning er en av fordelene med denne analysen fordi disse bakteriene er stabile og vise et sterk fluorescens signal, selv etter makrofager er løst av 4% (w/v) paraformaldehyde. I tillegg bruker den EGFP-uttrykke E. coli, forskere trenger ikke videre flekker etter fagocytose, noe som sparer tid. Videre er makrofager immunoresponsive for E. coli overflate antigen, gjør E. coli mer egnet for fagocytose analysen enn EGFP-uttrykke sopp eller fluorescein-merket perler.
Med EGFP-uttrykke E. coli, kan en fagocytose analysen lett oppnådd i 2t og målt ved begge flyt cytometri og fluorescens mikroskopi, avhengig av forskerens hensikt. Siden denne metoden måler direkte phagocytic evnen, er resultatene mer reproduserbar enn andre indirekte metoder.
Denne metoden har også blitt validert i en RAW264.7 celle linje og menneskelige perifert blod mononukleære celler4. Teksten nedenfor inneholder detaljerte trinnvise instruksjoner for å utføre denne analysen og uthever de avgjørende skritt som forskerne kan endre for å møte behovene til sine eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trinnene i denne protokollen er ganske enkel og grei. En av de avgjørende skritt er å indusere EGFP uttrykk på E. coli. Vanligvis når et gen fra eukaryoter, som EGFP, er planlagt å uttrykke prokaryoter som E. coli, er det en risiko for at protein vil danne inaktive aggregater (inkludering organer), som endrer protein’s opprinnelige struktur og aktivitet. Ved hjelp av pET-SUMO vektoren og lage pET-SUMO-EGFP plasmider, EGFP-SUMO fusion protein uttrykt vellykket, og lyssignal var sterk nok til å bli …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den National Natural Science Foundation i Kina (nr. 31800046) og Natural Science Foundation av provinsen Liaoning (nr. 20170540262) støttet dette arbeidet. Dette arbeidet ble gjort i laboratoriene i Scientific Research Center ved Universitetet i andre sykehus for Dalian medisinsk. Forfatterne vil gjerne takke Xiao-Lin Sang for henne hjelp med flowcytometri, og Bo Qu og Dong-Chuan Yang for deres hjelp i å produsere videoen.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
Referências
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
