I Vivo Målrettet uttrykk for Optogenetic proteiner med silke/AAV filmer
Summary
Her presenterer vi en metode for å levere viral uttrykk vektorer i hjernen ved hjelp av silke fibroin filmer. Denne metoden gir målrettet levering av uttrykket vektorer silke/AAV belagt optiske fibre, konisk optiske fibre og kraniale windows.
Abstract
Forsøk på å forstå hvordan nevrale kretser prosessinformasjon for å kjøre atferdsmessige produksjon har vært sterkt hjulpet av nylig utviklet optiske metoder for å manipulere og overvåke aktiviteten til neurons i vivo. Disse typer eksperimenter er avhengige av to hovedkomponenter: 1) implanterbare enheter som optiske tilgang til hjernen, og 2) lys-sensitive proteiner som endre neuronal excitability eller gi en presentasjon av neuronal aktivitet. Det er flere måter å uttrykke lys-sensitive proteiner, men stereotaxic injeksjon av viral vektorer er for tiden den mest fleksible tilnærmingen fordi uttrykk kan kontrolleres med genetisk anatomiske og tidsmessige presisjon. Til tross for stor nytte av viral vektorer, leverer viruset til området av optisk implantater utgjør mange utfordringer. Stereotaxic virus injeksjoner er krevende operasjoner som øke kirurgisk, øke kostnaden for studier og utgjør en risiko til dyrets helse. De omkringliggende vev kan være fysisk skadet ved injeksjon sprøyten og immunogenic betennelse forårsaket av brå levering av bolus av høy-titer virus. Justere injeksjoner med optisk implantater er spesielt vanskelig når målretting små dypt i hjernen. For å overvinne disse utfordringene, beskriver vi en metode for belegg flere typer optisk implantater med filmer består av silke fibroin og Adeno-assosiert virus (AAV) vektorer. Fibroin, en polymer avledet fra kokong av Bombyx mori, kan kapsle og beskytte biomolecules og kan bearbeides til former fra løselig filmer til keramikk. Når implantert i hjernen, slipper silke/AAV belegg virus på grensesnittet mellom optiske elementer og omkringliggende hjernen, kjører uttrykk nøyaktig hvor det er nødvendig. Denne metoden implementeres enkelt og lover å forenkle i vivo studier av nevrale krets-funksjonen.
Introduction
Det siste tiåret har produsert en eksplosjon av konstruert lys-sensitive proteiner for overvåking og manipulere nevrale aktivitet1. Virus gir enestående fleksibilitet for å uttrykke verktøyene optogenetic i hjernen. Sammenlignet med transgene dyr, er virus langt enklere å produsere, transportere og lagre, tillater rask implementering av de nyeste optogenetic verktøyene. Uttrykket kan være målrettet genetisk til forskjellige neuronal befolkninger, og virus designet for retrograd transport kan også brukes til å målrette uttrykk basert på neuronal tilkobling2.
Virus er vanligvis introdusert stereotaxic injeksjoner, som kan være tidkrevende og utfordrende. Nøyaktig målretting små kan være vanskelig, mens kjører uttrykk over brede områder ofte krever mange injeksjoner. Videre, når en optisk enhet er senere implantert i hjernen til å levere lys i vivo, protesen må være riktig justert med viral injeksjon. Her beskriver vi en enkelt-implementert metode for å levere viral vektorer til vev rundt en implantert enhet med silke fibroin filmer3. Silke fibroin er kommersielt tilgjengelig, godt tolerert av nevrale vev, og kan brukes til å produsere materiale med variert egenskaper. Silke filmer kan bli brukt til implantater bruk vanlig laboratoriet som microinjection Pipetter eller hånd pipetter. Silke/AAV filmer eliminere behovet for to surgical prosedyrer og sikre at virus-mediert uttrykk er riktig justert til optiske implantatet. Det resulterende uttrykket er begrenset til spissen av fiber og resultater i mindre uønskede uttrykk langs sporet fiber enn stereotaxic injeksjoner.
I tillegg produserer målrettet uttrykk på spissen av små fibre, silke/AAV filmer kan brukes til å kjøre utbredt (> 3 mm diameter) kortikale uttrykk under skallen windows. I vivo 2-fotonet avbilding av fluorescerende aktivitet sensorer har blitt et uunnværlig verktøy for å vurdere rollen neuronal aktivitet i kjøring sensorisk og kognitive behandling. Men for å kjøre uniform uttrykk over den brede kortikale områder, forskere ofte utføre flere injeksjoner. Disse injeksjoner kan være svært tidkrevende og kan føre til inkonsekvent uttrykk over synsfelt. Silke/AAV-belagt skallen windows er ekstremt lett å produsere reduserer tiden som kreves for operasjoner og mest bemerkelsesverdig kjøre uttrykket hundrevis av mikron under kortikale overflaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruk av silke/AAV målrette uttrykk for optogentic proteiner overvinner begrensninger av tilnærminger som er i bruk. Selv om mange studier bruke AAV injeksjoner for å uttrykke optogenetic proteiner, er det utfordrende å justere uttrykk til spissen av optiske fibre, regionene rundt lengden på konisk fiber og til visning regionen en GLISE-linse. På grunn av avvik mellom optisk komponenter og optogenetic uttrykk, stereotaxic injeksjoner kan være upålitelig, og mange forsøk mislykkes. Silke/AAV merking metoden som be…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke J. Vazquez for illustrasjoner, D. Kaplan og C. Preda for reagenser og nyttig veiledning og laboratorier i B. Sabatini og C. Harvey for i vivo bildebehandling. Mikroskopi ble gjort mulig av M. Ocana og nevrobiologi Imaging Center, støttes delvis av Neural Imaging Center som en del av en nasjonal Institute nevrologiske lidelser og strek (NINDS) P30 Core Center gir (NS072030). Dette arbeidet ble støttet av GVR Khodadad Family foundation, Nancy Lurie merker stiftelsen, og NIH tilskudd, NINDS R21NS093498, U01NS108177 og NINDS R35NS097284 til W.G.R, og en NIH postdoktorstipend F32NS101889 til C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
Referências
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
