На базе РНК перепрограммирование первичной фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Работать в условиях РНКазы бесплатно и использовать асептических методов, когда это возможно. Выполните все манипуляции связанные культуры клеток в кабинет с использованием асептических методов биологической безопасности. Следуйте стандартам институциональных биобезопасности для работы с клетками человека. 1. реагенты и оборудование для приготовления перепрограммирования посвящения Приготовьте коктейль кодирования перепрограммирования факторы изменения мРНК. Следуйте ранее опубликованные протокол10 для выполнения в vitro транскрипция, укупорка и dephosphorylation процедуры для каждого измененного мРНК, кодирование отдельных перепрограммирования фактор. После окончательной очистки шага элюировать модифицированных мРНК с нуклеиназы свободной воды, дополнить очищенный модифицированное решение мРНК с 1 битор РНКазы U/мкл, quantitate модифицированных мРНК, используя спектрофотометр и хранить при температуре-80 ° C до 6 месяцев. Подготовьте несколько аликвоты каждого измененного мРНК, чтобы свести к минимуму количество циклов замораживания оттаивания.Примечание: Аналогичные протоколы для модифицированных мРНК, производства были сообщила других5,8,11. Шаблоны для в vitro транскрипция может быть порождена амплификации PCR из соответствующих шаблонов плазмида с праймерами, перечисленные в Таблице материалов согласно ранее опубликованные протокол10. Плазмиды шаблоны для каждого перепрограммирования фактор (М3O9SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) и mWasabi (контроль для transfection) доступны из Addgene, некоммерческой плазмида репозитория. Смешайте все измененные mRNAs в молярное соотношение 3:1:1:1:1:1 (М3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) и включают в себя 10% как элемент управления для обеспечения эффективности transfection mWasabi изменение мРНК. Отрегулируйте концентрацию полное изменение мРНК, перепрограммирование перемешивают до конечной концентрации 100 нг/мкл, добавив воды, свободной от нуклеиназы дополнена 1 битор РНКазы U/мкл. Подготовьте семь 33 мкл аликвоты полное изменение мРНК коктейль. Хранить смешанный перепрограммирования аликвоты-80 ° c.Примечание: для каждого трансфекции 1000 нг модифицированных коктейль мРНК добавляется за хорошо (то есть, в общей сложности 3000 нг для 3 скважины). Каждый 33 мкл аликвота размером до transfect 3 скважины 6-ну формат плиты и включает в себя 3 мкл избыточного объема для учета дозирования ошибок. Подготовка 7 33 мкл аликвоты достаточно для завершения полного фибробластов перепрограммирования 3 скважин в формате 6-ну пластине. Приготовьте коктейль перепрограммирования имитирует Мирна. Растворите лиофилизированный имитирует микроРНК (Syn имеет мир 302a – 3p, Syn имеет мир 302b – 3p, Syn имеет мир – 302c – 3p, Syn имеет мир-302d-3 p, Syn имеет мир-367-3 p) до конечной концентрации 5 пмоль/мкл (5 мкм) в свободной от нуклеиназы воды с 1 U/мкл битор РНКазы. Подготовить несколько аликвоты каждого Мирна мимические и хранить при температуре-80 ° C для длительного хранения. Смешайте все Мирна имитирует в 1:1:1:1:1 молярное соотношение до конечной концентрации 5 пмоль/мкл (5 мкм). Подготовьте семь 14 мкл аликвоты Мирна имитирует микс. Хранить смешанный аликвоты-80 ° c.Примечание: Для каждого трансфекции, 20 пмоль Мирна имитирует смесь добавляется за хорошо (то есть, в общей сложности 60 пмоль для 3 скважины). Каждый 14 мкл аликвота размером до transfect 3 скважины 6-ну формат плиты и включает в себя 2 мкл избыточного объема для учета дозирования ошибок. Подготовка 7 14 мкл аликвоты достаточно для завершения полного фибробластов перепрограммирования 3 скважин в формате 6-ну пластине. Подготовьте трансфекции буфера. Предварительно теплой бутылка 500 мл и 1 флакон 100 мл свежей среды сокращение сыворотке до комнатной температуры (RT) для приблизительно 2Н. Не использовать на водяной бане. РН-метер передать биобезопасности кабинета. Помойте стеклянные электроды с нуклеиназы свободной воды. Калибровка pH метр согласно инструкциям изготовителя. Вымойте электрод снова с нуклеиназы свободной воды. Перевести обе бутылки сокращение сыворотке среды в кабинет биобезопасности. Используйте бутылка 500 мл RT для регулировки рН. Измерьте Базовый pH среды сокращение сыворотке, вставив Стеклянный электрод pH метр в буфер. Перед чтением pH на метр, подождите до 1 мин. Добавить 3-4 мл 1 M NaOH в 500 мл среды сокращение сыворотке, закройте бутылку и хорошо перемешать. Ждать до 5 мин, прежде чем открывать бутылку для измерения рН. Вставьте буфер рН электроды и подождите, пока чтение на pH метр стабилизируется. Продолжайте добавлять небольшие объемы 1 M NaOH до тех пор, пока pH среды сокращение сыворотке достигает 8.15 – 8.17. Калибровка pH метр несколько раз во время процесса. Если в любой момент pH становится выше, чем 8.18, уменьшить его, добавляя свежий сокращение сыворотке среднего из подогретым 100 мл бутылки (шаг 1.3.1).Примечание: pH буфера снижена сыворотка на основе среднего трансфекции имеет решающее значение. Перепрограммирование будет успешным, если pH буфера трансфекции около 8.2 ± 0,05 но может завершиться ошибкой, если рН выше чем 8,25. Поэтому рекомендуется прекратить добавление NaOH, когда буфер рН достигает 8.15 – 8.17. Это будет гарантировать, что окончательный рН трансфекции буфера является примерно 8.2 – 8.22 после стерилизации. Фильтр стерилизовать трансфекции буфера, используя систему вакуумной фильтрации 0,22 мкм. Алиготе стерилизованные буфера в 5 или 15 мл пробирки с минимальным воздушным пространством. Хранить аликвоты трансфекции буфера на срок до 3 месяцев при 4 ° C. Измерение pH аликвоты периодически. Если pH выше чем 8.25, отказаться от аликвоты. Ограничить аликвота использование 2 transfections только так, как воздействие буфера трансфекции атмосферного воздуха увеличивает pH буфера. Приготовить средство расширения фибробластов (FEM): минимум основных средних дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1 x несущественные аминокислот, 1 x глютамин добавки, 55 мкм 2-меркаптоэтанол, 1 х перо/воспаление/fungizone. Магазин FEM на 4 ° C. Подготовить перепрограммирования средний: DMEM/F12 (не HEPES) дополнены нокаут 20% сыворотки замена (KOSR), 0.5 x несущественные аминокислот, 0.5 x глютамин добавки, 55 мкм 2-меркаптоэтанол, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 1 х перо/воспаление/fungizone, bFGF 100 нг/мл и 200 нг/мл B18R. Подготовка среды в момент начала перепрограммирования без bFGF и B18R и хранить при 4 ° C. Не использовать его после 1 месяца после подготовки. Добавьте bFGF и B18R непосредственно перед каждым использованием Алиготе, размера для использования в тот день. Подготовка среднего покрытие, добавив 5% тепло инактивированных (HI) FBS в перепрограммирования носитель, содержащий 20% KOSR без bFGF и B18R на шаге 1.5. Подготовка среднего свежие в день предполагаемого использования. Добавление bFGF и B18R непосредственно перед использованием в день 0 перепрограммирования. Калибровка инкубаторы культуры ткани перед инициализацией перепрограммирования согласно инструкции производителя, используя портативный цифровой анализатор CO2 . Используйте низкий O2 инкубатора для перепрограммирования шаги для обеспечения успешного iPSC поколения. 2. культивирование фибробластов для перепрограммирования Подготовьте фибробластов до начала перепрограммирования (день -2). Герб новой культуры ткани плита 10 см с 5 мл 0,1% желатина. Коснитесь или закружить пластина обеспечить что вся поверхность покрыта. Инкубируйте 15 мин при температуре 37 ° C. Аспирационная желатина и добавляют 10 мл к ФЕМ набора сторону. Не позволяют покрытием поверхности пластины для просушки перед добавлением к ФЕМ. Тщательно аспирационная отработанного среднего из фибробластов. Промойте клетки один раз с 5 мл DPBS для удаления остаточных сыворотки. Добавьте 3 мл трипсина-ЭДТА. Осторожно покачайте пластина обеспечить полный охват над клетки. Аспирационная лишнюю жидкость, оставляя ~ 500 мкл трипсина. Не чрезмерно аспирационная, поскольку это может высушить и убить фибробластов. Инкубировать фибробластов с трипсина ЭДТА на 3 мин при температуре 37 ° C. Снять пластину из инкубатора и твердо, но осторожно коснитесь стороне пластины выбить клетки. Проверьте клетки под микроскопом. Если клетки отдельностоящий и плавающий, продолжить. Если клетки по-прежнему прилагаются, Инкубируйте еще 3 мин. Быстро промыть/собирать отдельные ячейки, используя 5 мл ФЭМ для нейтрализации трипсина ЭДТА. Переместите подвеска фибробластов в 15 мл Конические трубки. Убедитесь, что клетки перемешанных. Аккуратно перемешайте суспензию клеток разорвать большие скопления клеток, а затем подсчитать их на Горяева. Передачи 2,5 x 105 клеток в желатин покрытием 10 см блюдо, приготовленное в шаге 2.1.1. Инкубируйте клетки на ночь в 37 ° C, 5% CO2 увлажненные регулярные культуры ткани инкубатора.Примечание: Плотность клеток имеет решающее значение для достижения высокой эффективности перепрограммирования, как важно, что фибробласты здоровым и быстро делящиеся. Обшивка 2,5 x 105 клеток дает 40-60% confluency 2 дня позже для большинства образцов фибробластов. Скорректировать сумму за больными или стареющей клетки для достижения желаемого 40-60% confluency 48 h позже. Замените носитель 10 мл свежего ФЭМ следующий день (-1). Пластина фибробластов инициировать перепрограммирования (день 0). Убедитесь, что фибробласты чтобы перепрограммировать на 40 – 60% confluency (рис. 2, день 0). Если клетки над – или недостаточного притока, проход фибробласты, как описано в шаге 2.1 и соответствующим образом корректировать плотность покрытия. Культура для еще 2 дней. Передача 4 мл DPBS в 15 мл Конические трубки. 100 мкл рекомбинантных человека (rh) Ламинин-521. Пипетка вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Добавьте 1 мл на хорошо разбавленных rhLaminin-521 в 3 скважины 6-ну плиты. Инкубируйте пластину с покрытием при 37 ° C на 2 ч. Теплый 6 мл FEM и 4 мл покрытие средне-37 ° C. Дополнить покрытия среды с bFGF до конечной концентрации 100 нг/мл и B18R до конечной концентрации 200 нг/мл. Тщательно аспирационная отработанного среднего из фибробластов (шаг 2.2.1). Промойте клетки с 5 мл DPBS и добавить 3 мл трипсина-ЭДТА. Осторожно покачайте плиты для покрытия клетки с трипсина ЭДТА. Аспирационная лишнюю жидкость, оставляя ~ 500 мкл трипсина, как это сделано в шаге 2.1.3. Инкубировать фибробластов с трипсина ЭДТА на 3 мин при температуре 37 ° C. Снять пластину из инкубатора и твердо, но осторожно коснитесь стороне пластины выбить клетки. Проверьте клетки под микроскопом. Если клетки отдельностоящий и плавающий, продолжить. Если клетки по-прежнему прилагаются, Инкубируйте еще 3 мин. Промыть/собирать отдельные ячейки, используя 5 мл ФЭМ для нейтрализации трипсина ЭДТА. Переместите подвеска фибробластов в 15 мл Конические трубки. Убедитесь, что клетки перемешанных и считать их на Горяева. Пипетка 12000 клетки в 4 мл среды подогретую обшивка из шага 2.2.4.Примечание: Не центрифуга клетки в любой точке. Количество покрытием клеток может корректироваться вверх или вниз как необходимые для медленно или быстро растущих линий, соответственно. Снять пластину с покрытием из инкубатора и аспирационная разбавленных rhLaminin-521 с покрытием скважин. Не позволяют поверхности лунки для просушки. Нежно ресуспензируйте клеток в среде обшивки. Пипетка 1 мл суспензии клеток в каждой покрытием хорошо (т.е., 3000 клетки за хорошо). Поместите покрытием клетки в tri Газовый инкубатор культуры ткани с O2 равным 5% (низкий O2). Как только пластину, мягко, но тщательно разогнать клетки, чередуя движение вверх/вниз, затем влево/вправо. Повторите движения 2 раза. Инкубируйте клетки на ночь. Не вихрем пластину для смешивания. Пипетка 4 мл перепрограммирования средне-15 мл Конические трубки и поместите его в низкой O2 инкубатора ослабил крышкой, чтобы сбалансировать на ночь. Не добавляйте bFGF и B18R до следующего дня. 3. начало перепрограммирование (1 день) Примечание: После перепрограммирования инициируется, ежедневное обслуживание не требуется для примерно 1 месяц. Убедитесь в том планировать соответственно. Все последующие ячейки инкубаций должны выполняться в условиях низкой O2 в 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 увлажненные tri Газовый инкубатор культуры ткани. Замените покрытие среднего по крайней мере 1 h до transfection. Удалите средство уравновешенной перепрограммирования из низкой O2 инкубатора. Добавьте bFGF в конечной концентрации 100 нг/мл и B18R до конечной концентрации 200 нг/мл. Хорошо перемешайте. Исходя с 1 хорошо в то время, используйте 1 мл пипетки для удаления отработанного среднего и заменить его 1 мл перепрограммирования среды, дополненная bFGF и B18R. Повторите это действие для каждой скважины. Не следует использовать вакуум-аспирации, который чрезмерно высушивает клетки, вызывает стресс и снижает эффективность перепрограммирования. Переместите пластину с клетками обратно в низкой O2 инкубатора. Transfect фибробластов с 5 мкл Реагента transfection RNAiMax за 1 мкг модифицированных мРНК, и 1 мкл Реагента трансфекции за 6 пмоль Мирна имитирует за transfection.Примечание: Оптимальные результаты получаются при transfections перейти на 16 – 20 ч. Трансфекция реагент является разбавленной 10 x; 100 нг/мкл, является изменение мРНК коктейль разбавляют 5 x; и 5 имитирует пмоль/мкл Мирна, что смесь разбавляют 8,33 x с трансфекции буфера до комплексообразования. Резюме трансфекции установки см. в таблице 1 . При подготовке трансфекции смеси, свести к минимуму потенциального воздействия реагентов РНКазы, следуя стандартным лабораторной практики. Сбалансировать Алиготе трансфекции буфера (шаг 1.3) для примерно 1 час на RT. Не использовать ванну воды 37 ° C или инкубатор для разогрева трансфекции буфера. Удаление одного Алиготе модифицированных mRNAs (33 мкл) и Мирна имитирует (14 мкл) от-80 ° C и согреть их для RT для примерно 3-5 мин, до тех пор, пока растаяло. Не размораживать аликвоты при 37 ° C. Спина их вниз кратко в отцентрифугировать. Теплый трансфекции реагент для RT для примерно 3-5 мин. Не использовать ванну воды 37 ° C или инкубатора. Инвертировать закрытой трубе 2 – 3 раза перемешать Реагент. Спина его вниз кратко в отцентрифугировать. Перевести 279 мкл буфера трансфекции RT в пробки microcentrifuge РНКазы бесплатно. 31 мкл Реагента трансфекции для достижения окончательный объем 310 мкл. смесь тщательно, закупорить. Сделать не вихря. Инкубируйте трубки в РТ за 1 мин.Примечание: Этот объем разреженных трансфекции реагента достаточно для сложных модифицированных мРНК и Мирна имитирует аликвоты из шага 3.2.3. 132 мкл буфера трансфекции RT, в 33 мкл Алиготе модифицированных мРНК. Пипетка осторожно смешать: окончательный объем составляет 165 мкл. Мкл 102.6 RT трансфекции буфера для 14 мкл Алиготе имитирует Мирна. Пипетка осторожно смешать: окончательный объем является 116.6 мкл. Добавьте что 165 мкл Реагента разреженных трансфекции из шага 3.2.5 для разреженных изменение мРНК из шага 3.2.6. Пипетка для смешивания: окончательный объем составляет 330 мкл. Добавьте 116.6 мкл Реагента разреженных трансфекции из шага 3.2.5 разреженных Мирна имитирует смесь из шага 3.2.7. Хорошо перемешайте (конечный объем является 233.2 мкл). Инкубируйте 15 мин на RT, чтобы позволить трансфекции буфера комплекс с модифицированных мРНК и имитирует Мирна. Снимите крышку с ячейками от низкой O2 инкубатора. Добавьте 100 мкл (1 мкг) complexed изменение мРНК трансфекции смеси для каждой скважины, каплям через скважины. Разогнать трансфекции комплексы, мягко, но тщательно агитацию пластину с движением вверх/вниз, затем влево/вправо. Не вихрем пластину для смешивания. Мкл 66,7 (20 пмоль) complexed Мирна имитирует трансфекции смеси для каждой скважины, каплям через скважины. Разогнать трансфекции комплексы, мягко, но тщательно агитацию пластину с движением вверх/вниз, затем влево/вправо. Не вихрем пластину для смешивания. Поместите transfected клеток в tri Газовый инкубатор с O2 равным 5% (низкий O2). Как только пластину, разогнать трансфекции комплексы снова мягко но тщательно агитацию пластину с движением вверх/вниз, затем влево/вправо. Пипетка 4 мл перепрограммирования среднего в 15 мл Конические трубки и поместите его в низкой O2 инкубатора с ослабил шапку, чтобы сбалансировать на ночь. Не добавляйте bFGF и B18R до следующего дня. Труба 1 – RNAiMax разрежения (1 mix) Реагент Концентрация Объем Трансфекция буфер 279 МКЛ RNAiMax (Добавление 2) 10 x 31 МКЛ Итого: 310 мкл (1 мин при комнатной температуре инкубации) Труба 2 – изменение мРНК смесь (2-микс) Реагент Концентрация Объем изменение мРНК микс 100 нг/мкл (5 x) 33 МКЛ Трансфекция буфер 132 МКЛ Итого: 165 мкл (добавьте одинаковый объем разреженных RNAiMax с трубки 1) Труба 3 – miRNA имитирует смешивать (3-микс) Реагент Концентрация Объем Мирна имитирует микс 5 пмоль/мкл (8.33 x) 14 МКЛ Трансфекция буфер 102.6 МКЛ Итого: 116.6 мкл (добавьте одинаковый объем разреженных RNAiMax с трубки 1) Таблица 1: Подготовка трансфекции смеси. 4. Замена перепрограммирование среднего между Transfections (2, 4, 6, 8, 10 и 12 дней) Замените после трансфекции средних 16 – 20 h, как описано в 3.1.1–3.1.2. Добавьте bFGF в конечной концентрации 100 нг/мл и B18R до конечной концентрации 200 нг/мл в перепрограммирования средних аликвоты. Мониторинг mWasabi выражение ежедневно, чтобы подтвердить трансфекции качества с помощью микроскопа, настроенные для визуализации EGFP.Примечание: mWasabi выражение должно быть очевидным, минимально на 2 день и увеличение яркости с каждой дополнительной transfection. 5. каждый-другие-день Transfections (3, 5, 7, 9, 11 и 13 дней) Выполните трансфекции, как описано в шаге 3.2. Не изменяйте среды на дни transfection. Подготовка 4 мл Алиготе перепрограммирования среднего и поместите его в низкой O2 инкубатора чтобы сбалансировать для среднего изменения на следующий день. Не добавляйте bFGF и B18R до следующего дня. 6. процедуры после окончательного Transfection Выполнять ежедневные среднего изменения от 14 день через приблизительно 17-й день. Теплый 7 мл перепрограммирования средне-37 ° C. Добавьте bFGF в конечной концентрации 100 нг/мл.Примечание: B18R отпадает после окончательного transfection. За день 14 это больше не нужно сбалансировать среднего ночь в низкой O2 инкубатора. Удалите средство от всех скважин с использованием Серологические Пипетки. Продолжать избегать использования аспирации. Добавьте 2 мл перепрограммирования среднего дополнена bFGF за хорошо. В дни, 17 и 18 анализируйте перепрограммировать скважин под рассечения или инвертированный микроскоп. Если колонии формируются в непосредственной близости друг от друга из-за высокой эффективности перепрограммирования и может быть вручную изолированные, отдельные колонии, выполняя Факультативный пассированый перепрограммировать скважин, описанный в шаге 7 ниже. Если колонии являются разреженные и хорошо разделяются, вручную выберите клоны непосредственно от перенесенной хорошо, как описано в шаге 8 и iPSCs субкультура согласно стандартных протоколов. 7. факультативные процедуры: Пассированый клетки от перепрограммировать скважин с использованием ЭДТА Подготовьте 0,5 мм ЭДТА в DPBS (ЭДТА) путем разбавления ЭДТА Стоковый раствор 0,5 М. Фильтр стерилизуют EDTA, с использованием системы вакуумной фильтрации 0,22 мкм. Подготовка среднего фидер бесплатно плюрипотентных стволовых клеток (PSC) (например, mTeSR1) согласно инструкциям производителя. Предварительно теплой 32 мл PSC средних 37 ° C. Покройте все скважины двух 6-ну формат пластин с Госкомсанэпиднадзором квалифицированных внеклеточного матрикса (ECM) следуя инструкциям производителя. Печать пластины с парафином пленкой и инкубировать их за 1 час на RT. Аспирационная решение ECM с подогретым пластин и заменить его с 2 мл среды PSC в колодец. Не позволяют поверхности лунки для просушки. Отложите их в сторону. Аспирационная перепрограммирования среднего от 2 перепрограммировать скважин в день, когда колонии большие и четко сформированный (обычно 18 день). После промойте с 1 мл раствора ЭДТА и аспирата. Добавьте 1 мл ЭДТА на хорошо. Инкубируйте 4 мин при 37 ° C. Осторожно удалить пластину из инкубатора и поместите его в биобезопасности кабинета.Примечание: на данный момент, клетки могут быть очень слабо придерживался и легко выбили. Тщательно аспирационная ЭДТА с обеих скважин. Добавьте 3 мл подогретым PSC среднего для каждой хорошо относиться с ЭДТА. Использование ячейки скребок мягко, но тщательно выбить клетки от обеих скважин. Используйте Серологические Пипетки для нежно Пипетка суспензию клеток и распадаются крупные сгустки. Не Пипетка, пока все ячейки сгустки ушли. Сохраните iPSC кластеров.Примечание: Обшивка большого скопления не повлияет iPSC колонии нарост. Если существует чрезмерно больших клеток сгустки, просто Избегайте их перевода в следующий блюдо. С помощью Серологические Пипетки, равномерно распределять клетки от каждой скважины, ЭДТА лечение дозирования 0,5 мл в каждую лунку пластину 6-ну ECM-покрытием.Примечание: Не смешивайте клетки от перенесенной скважин (т.е., перепрограммировать хорошо 1 следует равномерно распределены в первые 6-ну пластину, и перепрограммировать хорошо 2 следует равномерно распределены в пластину второй 6-ну). Переместите покрытием клетки обратно в низкой O2 инкубатора. Чтобы равномерно распределить клетки, встряхните каждой плиты возвратно поступательное и side-to-side. Не водоворот. Замените средство PSC ежедневно. 8. сбор iPSC колоний Предварительно теплой 15 мл PSC средних 37 ° C. Покройте всех скважин одной пластине 6-Ну с Госкомсанэпиднадзором квалифицированных ECM следуя инструкциям производителя. Печать пластины с парафином пленкой и инкубировать их за 1 час на RT. Аспирационная питательной среды из скважин используются для сбора iPSCs. После промойте с 1 мл раствора ЭДТА и аспирата. Добавьте 1 мл ЭДТА на хорошо. Инкубируйте 4 мин при 37° C. В то время как инкубации клеток, аспирационная решение ECM с подогретым пластин и заменить 2 мл PSC среднего за хорошо. Отложите пластины. Осторожно удалите пластину с iPSCs взял из инкубатора и поместить его в области биобезопасности кабинета.Примечание: на данный момент, клетки могут быть очень слабо придерживался и легко выбили. Тщательно аспирационная ЭДТА. Очень аккуратно добавьте 3 мл подогретым PSC среды, стараясь не выбить iPSC колоний. Перемещение, пластину для рассечения или инвертированный область лучше визуализировать колоний. Подготовьте 1 мл пипетки с стерильных наконечником. Угнетают плунжер полностью, а затем аккуратно почистить колонии рисуя медленно жидкости в наконечник для сбора колонии в наконечник пипетки. Рисование как мало среды как можно при выборе iPSC колонии. Для передачи в колонии, Пипетка вверх и вниз 3-4 раза в одной хорошо ECM-покрытием плиты из шага 8.2. Повторяйте до тех пор, пока 6 колонии были собраны и переведены в индивидуальные добра. Выбрать не более 2 колонии от любого одного хорошо если необязательный пассированый описано в шаге 7 было выполнено. Используйте стандартный стволовых клеток человека протокол для замораживания вниз все остальные скважины. Размораживание и повторно пластины замороженные запасы, если больше колоний должны быть собраны позже. 9. характеристика iPSCs Выполните, TRA-1-60 пятная для анализа перепрограммирования эффективности (18 день).Примечание: 2 из 3 перепрограммировать скважин пассированные для будущих колонии комплектации. Остальные могут использоваться также для окрашивания TRA-1-60. Эта процедура может быть выполнена на вершине стенде лаборатории. Вымойте перепрограммировать хорошо с 1 мл раствора PBS. Исправьте клетки с ледяной метанола при-20 ° C за 5 мин. Аспирационная метанола. Сухой колодец для около 2 мин. Будьте осторожны, чтобы не слишком сухой. Клетки сушеные достаточно, когда они становятся полупрозрачными/матовый цвет. Мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания. Во время мойки Подготовьте 3 мл 3% перекиси водорода в PBS. Аспирационная PBS. Добавьте 2 мл разбавленного раствора перекиси. Инкубируйте 15 мин на RT с нежным встряхивания. Подготовка 4 мл раствора блокировки: 10% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. Аспирационная перекисного раствора. Мыть хорошо 2 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин. Аспирационная PBS и добавить 2 мл блокирования раствора в скважину. Инкубировать 1 час на RT. Мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания. Разбавьте основного антитела анти TRA-1-60 на 1: 100 в решении блокировки, дополнена азид натрия 0.05%. Готовим 1 мл разбавления антитела для 1 хорошо блюдо 6-ну формат. Добавьте разбавления антитела к колодцу и обернуть тарелку с парафина, чтобы избежать испарения. Инкубируйте на ночь при 4 ° C с нежным встряхивания.Примечание: При необходимости, инкубация с основное антитело может быть сделано за 1 час на RT с нежным встряхивания. Основное антитело разрежения может повторно использоваться до 5 раз. После инкубации с основного антитела мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания. Разбавленных вторичных HRP-конъюгированных антител анти мыши при 1: 200 в решении блокировки. Инкубируйте колодец с вторичное антитело разбавления 2 h на RT с нежным встряхивания. Аспирационная вторичное антитело разрежения и мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания. Во время третьей стирки Подготовьте раствора субстрата после инструкции производителя. После окончательной стирки аспирационная PBS. Добавить 1 мл раствора субстрата и инкубировать до тех пор, пока желаемый цвет развивается (примерно 10 минут). Аспирационная раствора субстрата. Промойте колодец с водой в течение 5 мин при нежно тряска. Подсчет колоний, при желании. Перепрограммирование эффективность = (количество колоний) / (количество покрытием фибробластов) х 100%. Для длительного хранения аспирационная воды от окрашенные пластины и просушите на ночь на RT. Seal сушеные пластины с парафина и хранить при 4 ° C на срок до 2 лет для оценки эффективности перепрограммирования позже.