Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun
Summary
Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.
Abstract
En hücresel belirli bir gen programları transkripsiyon modülasyon tarafından düzenlenmektedir. Böyle modülasyon transkripsiyon faktörleri (TFs) ve transkripsiyon harekete geçirmek ya da baskı yoluyla kromatin yapısı değişimler arabuluculuk Kofaktörler geniş bir Birleşik eylemler yoluyla elde edilir. Histon değişiklikler eşleme ve transkripsiyon faktörleri/Kofaktörler DNA için bağlama profil oluşturma, böylece bir anlık görüntüsünü farklı sırasında meydana gelen dinamik nükleer değişiklikleri sağlamak için yararlı moleküler biyoloji yaklaşım kromatin immunoprecipitation (ChIP) olduğunu biyolojik süreçleri.
Yağ dokusu transkripsiyon Yönetmelikte çalışmaya, vitro hücre kültürleri türetilmiş örnekleri ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücre hatları kez çip deneyleri içinde malzeme başlayan bereket nedeniyle tercih ve biyolojik değişkenlik azaltılmış. Ancak, bu modeller canlı organizmalar gerçek kromatin durumda sınırlı bir kesitini temsil eder. Böylece, hayvan modellerden elde edilen yağ doku örnekleri üzerinde çip gerçekleştirmek en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları için kritik bir ihtiyaç vardır.
Burada bir iletişim kuralı için verimli ChIP-seq histon modifikasyonları ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) bir fareden izole olmayan histon proteinleri, açıklayın. Protokol genom çapında yerelleştirme faiz ve yağ depoları arasında morfolojik ve fizyolojik olarak ayrı bir dokudur yarasa epigenetik işaretleyicilerini proteinlerin soruşturma için optimize edilmiştir.
Introduction
Beyaz Yağ dokusundan (WAT) enerji depolama için uzman iken, kahverengi yağ dokusundan (BAT) karbonhidratlar ve yağlar termal enerji ile mitokondrial uncoupling1dönüştürmek için onun yetenek nedeniyle ısı formunda enerji kalır. Bu özel işlevi nedeniyle yarasa Depo bakımı vücut ısısı fizyolojik koşullarda ve yanıt-e doğru soğuk pozlama için gereklidir. Gen ifade değişiklikleri sırasında yarasa farklılaşma ve termojenik stres üzerine kapsamlı bir şekilde içinde vivo ve tüp bebek incelenmiştir, bu değişiklikler temel moleküler mekanizmaları çoğunlukla disseke ölümsüzleştirdi hücre hatlarında ve birincil edilmiş öncesi adipositler, birkaç içinde vivo çalışmalar2,3,4,5dışında.
Düzenleme, belirli bir gen ifade transkripsiyon düzenleme programlarını koordine değişiklikleri çeşitli transkripsiyon faktörleri ve ortak eylemler faktörler kromatin yapısı ile elde edilir. Kromatin immunoprecipitation (ChIP), işe alım için DNA bu faktörlerin araştırılması ve kromatin manzara ilişkili değişimler profil oluşturma için bir değerli moleküler biyoloji yaklaşımdır. ChIP deneyler başarısı için önemli faktörler crosslinking koşullar ve farklı örnekleri, boyunca kromatin kesme tutarlılık yeterli Başlangıç materyali ve en önemlisi, antikorlar kalitesini en iyi duruma getirmeleri içerir. ChIP bütün dokulardan gerçekleştirirken, heterojen örnekleri göz önünde bulundurun ve çekirdekleri yalıtım verimliliğini artırmak için iletişim kuralı en iyi duruma getirmek önemlidir, ikincisi ile özellikle hassas bir adım olması nedeniyle yağ dokusu ile çalışırken yükseltilmiş lipid içerik. Aslında, tüm yağ depoları moleküler yalıtım teknikleri trigliserid düzeyi yüksek varlığı ile karmaşık ve protokolleri kromatin yalıtım miktarını artırmak için optimize edilmiş olması gerekir. Yüksek işlem hacmi sıralama sonra ChIP-DNA izolasyon gerçekleştirildiğinde, son olarak, sıralama derinlik güvenle algılanır doruklarına sayısını belirlemek için önemlidir.
Burada, biz çalışma standartları ve kodla ve modENCODE konsorsiyumlar6 için en iyi yöntemler tarafından önerilen ChIP-seq deneyler için genel kurallar bakın ve ChIP-seq yarasa üzerinden için optimize edilmiş bir protokol, adım adım açıklamasını odaklanmak. DNA’ya bağlanıcı faktörler iyi tanımlanmış zirveleri ile hem de histon işaretleri kapatıyor sinyalleri ile genom çapındaki sıralama gerçekleştirmek için açıklanan protokol kromatin Yağ dokusundan verimli izolasyon sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokolü üzerinden fare dokular, özellikle kahverengi yağ dokusu için en iyi duruma getirilmiş ChIP yerine getirmek için değerli bir araç temsil eder. Hücreleri yeterli sayıda numune hazırlama sırasında yapılan çip dokudan işlemlerinde büyük zorluklardan biri kurtarıyor. SOPAYI önemli ölçüde paslanmaz çelik boncuk yerine bir kanonik cam havaneli ile birleştiğinde bir doku homogenizer blender kullanarak kesme kırılmamış doku nedeniyle kayıp hücre sayısını azaltır. A…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
