Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino
Summary
Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.
Abstract
Procesos más celulares son regulados por modulación transcripcional de programas gen específico. Dicha modulación se logra a través de la acción combinada de una amplia gama de factores de transcripción (TFs) y cofactores mediando la activación transcripcional o represión a través de cambios en la estructura de la cromatina. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método de biología molecular útiles para mapeo de modificaciones de las histonas y perfiles de transcripción factores/cofactores vinculante al ADN, proporcionando una instantánea de los cambios nucleares dinámicos que ocurren en diferentes procesos biológicos.
Para estudiar la regulación transcripcional en el tejido adiposo, muestras procedentes de cultivos en vitro de células de inmortalizaron o líneas de células primarias son favorecidas a menudo en los ensayos de ChIP debido a la abundancia de material de partida y reducción variabilidad biológica. Sin embargo, estos modelos representan una instantánea limitada del estado real de la cromatina en organismos vivos. Así, hay una necesidad crítica de protocolos optimizados realizar ChIP en muestras de tejido adiposo procedentes de modelos animales.
Aquí se describe un protocolo para eficiente ChIP-seq de modificaciones de las histonas y proteínas no histonas en el tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. El protocolo está optimizado para la investigación de genoma localización de proteínas de interés y marcadores epigenéticos en el murciélago, que es un tejido morfológicamente y fisiológicamente distinto entre los depósitos de grasa.
Introduction
Mientras que el tejido adiposo blanco (WAT) es especializado para el almacenamiento de energía, el tejido adiposo marrón (BAT) se disipa energía en forma de calor debido a su capacidad de convertir energía térmica via mitocondrial desacoplar1hidratos de carbono y lípidos. Debido a esta función especializada, el depósito BAT es necesario para el mantenimiento de la temperatura corporal en condiciones fisiológicas y en respuesta a la exposición fría. Mientras que los cambios de expresión génica durante la diferenciación de BAT y sobre estrés termogénico han sido extensivamente estudiadas in vivo e in vitro, los mecanismos moleculares subyacentes a estos cambios han sido en su mayoría disecados en líneas celulares inmortalizadas y primaria pre-adipocitos, con la excepción de varios estudios in vivo2,3,4,5.
Reglamento de programas de expresión de genes específicos a través de la regulación transcripcional se logra por cambios coordinados en la cromatina estructura mediante transcripción de diversos factores y factores conjuntamente acciones. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un enfoque valioso biología molecular para investigar la contratación de estos factores al ADN y para perfilar los cambios asociados en el paisaje de la cromatina. Factores clave para el éxito de los experimentos de ChIP incluyen optimizaciones de reticulación condiciones y consistencia corte de cromatina a lo largo de las diferentes muestras, la disponibilidad del material de partida adecuado y, en particular, la calidad de los anticuerpos. Cuando se realiza el ChIP de tejidos todo, también es importante considerar la heterogeneidad de las muestras y optimizar el protocolo para mejorar la eficiencia del aislamiento de los núcleos, el último siendo un paso particularmente sensible cuando se trabaja con el tejido adiposo debido a el contenido de lípidos elevados. De hecho, técnicas de aislamiento molecular de depósitos conjunto adiposos son complicadas por la presencia de niveles altos de triglicéridos, y protocolos deben ser optimizados para aumentar la cantidad de aislamiento de la cromatina. Finalmente, cuando se realiza la secuenciación de alto rendimiento después de ChIP de ADN, la profundidad de la secuencia es fundamental para determinar el número de picos que se detectan con confianza.
Aquí, nos referimos a las normas de trabajo y lineamientos generales para los experimentos de ChIP-seq recomendados por el consorcio ENCODE y modENCODE6 para las mejores prácticas, y nos centramos en una descripción paso a paso de un protocolo optimizado para el ChIP-seq de palo. El protocolo descrito permite eficiente aislamiento de cromatina del tejido adiposo para realizar la secuenciación del genoma para factores de unión al ADN con picos bien definidos así como marcas de histonas con las señales más difusas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí representa una herramienta valiosa para realizar ChIP de tejidos murinos, específicamente optimizados para el tejido adiposo marrón. Uno de los mayores desafíos en la realización de la viruta del tejido recupera una cantidad suficiente de células durante la preparación de la muestra. Corte el bate con una batidora de homogenizador de tejido juntada con granos de acero inoxidable en lugar de un mortero de vidrio canónico significativamente reduce el número de células perdidas debido al…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
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