Иммунопреципитации Chromatin мышиных коричневый жировой ткани
Summary
Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации эффективного chromatin (обломока) следуют высокопроизводительного секвенирования ДНК (чип seq) коричневый жировой ткани (BAT), изолированных от мыши. Этот протокол является подходящей для сопоставления изменения гистона и изучения генома всей локализации не гистоны интерес в vivo.
Abstract
Наиболее клеточные процессы регулируются транскрипционный анализ модуляции программ конкретных генов. Такие модуляции достигается за счет комбинированного действия широкого круга факторов транскрипции (TFs) и кофакторов, посреднические transcriptional активации или репрессий через изменения в структуре хроматина. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является полезным молекулярной биологии подход для сопоставления изменения гистона и профилирование транскрипции факторы/кофакторов привязки к ДНК, обеспечивая моментальный снимок динамических ядерные изменения, происходящие во время различных биологические процессы.
Для изучения регуляцию в жировой ткани, увековечен образцов, полученных в пробирке клеток культур или начальные клеточные линии часто выступает в чип анализов из-за обилия исходного материала и снижение биологической вариативности. Однако эти модели представляют ограниченный снимок состояния фактической хроматина в живых организмах. Таким образом существует насущная потребность оптимизированный протоколов для выполнения чип на образцах адипозных тканей, полученных от животных моделей.
Здесь мы описываем протокол для эффективного чип seq изменения гистона и гистоны в коричневый жировой ткани (BAT), изолированных от мыши. Протокол оптимизирован для изучения генома общесистемной Локализация белков интерес и эпигенетические маркеры в BAT, который является морфологически и физиологически собственный ткани среди жировых депо.
Introduction
В то время как белой жировой ткани (Ват) специализирован для хранения энергии, коричневая жировая ткань (BAT) рассеивает энергию в виде тепла из-за его способность преобразовать углеводы и липиды в тепловой энергии через Митохондриальные расцеплять1. Из-за этой специализированной функции BAT депо требуется для поддержания температуры тела в физиологических условиях и в ответ на холодной воздействия. В то время как изменения выражения гена во время дифференциация BAT и после термогенный стресса были широко изучены в vivo и in vitro, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений были в основном расчлененный в увековечен клеточных линий и первичной предварительно адипоциты, за исключением нескольких в vivo исследований2,3,4,5.
Регулирование конкретных генов выражение программ через регуляцию достигается путем скоординированных изменений chromatin структуры через различные транскрипции факторы и факторы совместного действия. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является ценным молекулярной биологии подход для изучения набора этих факторов ДНК и для профилирования связаны изменения в ландшафте хроматина. Ключевые факторы успеха чип экспериментов включают оптимизацию условий сшивки и хроматина сдвига последовательности на протяжении различных образцов, наличие адекватных исходного материала, и, прежде всего, качество антител. При выполнении чип от всей ткани, важно также учитывать неоднородность образцов и оптимизировать протокол для повышения эффективности работы ядер изоляции, с последним будучи особо чувствительных шаг при работе с жировой ткани из-за содержание повышенных липидов. В самом деле методы молекулярной изоляции от всего жировых депо осложняется наличием высокий уровень триглицеридов, и протоколы должны быть оптимизированы для увеличения объема хроматина изоляции. Наконец когда высокопроизводительного секвенирования проводится после чип-ДНК изоляции, глубина последовательности имеет решающее значение для определения числа вершин, которые уверенно распознаются.
Здесь мы ссылаемся на стандарты работы и общие руководящие принципы для чип seq экспериментов, рекомендованный кодирования и modENCODE консорциумов6 для наилучшей практики, и мы концентрируем внимание на пошаговое описание протокола, оптимизированный для чип seq от Бат. Для эффективной изоляции хроматина из жировой ткани описанных протокол позволяет выполнять генома общесистемной последовательности ДНК связывающих факторов с четко определенными пики, а также меток гистона с более диффузный сигналов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь представляет собой ценный инструмент для выполнения чип из мышиных тканей, специально оптимизированный для коричневая жировая ткань. Одна из более проблем в выполнении чип из ткани является восстановление достаточное количество клеток во время подготовки п?…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
