Chromatin Immunoprecipitation av Murine brun fettvev
Summary
Her beskriver vi en protokoll for effektiv chromatin immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av høy gjennomstrømming DNA sekvensering (ChIP-seq) av brun fettvev (BAT) isolert fra mus. Denne protokollen er egnet for både kartlegging histone modifikasjoner og undersøker genomet hele lokalisering av ikke-histone proteiner av interesse i vivo.
Abstract
Mest cellulære prosesser er regulert av transcriptional modulering av bestemte genet programmer. Slike modulering oppnås gjennom kombinert handlingene til en rekke transkripsjonsfaktorer (TFs) og kofaktorer formidling transcriptional aktivisering eller undertrykkelse via endringer i chromatin-strukturen. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en nyttig molekylærbiologi metode for kartlegging histone modifikasjoner og profilering transkripsjon faktorer/kofaktorer binding til DNA, noe som gir et øyeblikksbilde av dynamisk kjernefysiske endringene skjer under ulike biologiske prosesser.
For å studere transcriptional regulering i fettvev, prøver fra i vitro cellekulturer av udødeliggjort eller primære linjer er ofte foretrukket i ChIP analyser på grunn av overflod av starter materiale og redusert biologisk variasjon. Men representerer disse modellene et begrenset øyeblikksbilde av faktiske chromatin i levende organismer. Dermed er det et kritisk behov for optimalisert protokoller utføre ChIP på fettvev prøver fra dyremodeller.
Her beskriver vi en protokoll for effektiv ChIP-seq histone modifikasjoner og ikke-histone proteiner i brun fettvev (BAT) isolert fra mus. Protokollen er optimalisert for å undersøke genomet hele lokalisering av proteiner av interesse og epigenetic markører i balltre, som er en morphologically og fysiologisk forskjellige vev blant fett depoter.
Introduction
Mens hvit fettvev (WAT) er spesialisert for energilagring, forsvinner brun fettvev (BAT) energi i form av varme på grunn av sin evne til å konvertere karbohydrater og lipider i termisk energi via mitokondrie uncoupling1. På grunn av denne spesielle funksjonen er BAT depot nødvendig for vedlikehold av kroppstemperatur i fysiologiske forhold og svar på kalde eksponering. Mens gene expression endringer under BAT differensiering og thermogenic stress har vært grundig studert i vivo og in vitro, har molekylær mekanismene bak disse endringene vært mest dissekert i udødeliggjort linjer og primære pre adipocytter, med unntak av flere i vivo studier2,3,4,5.
Reguleringen av bestemte genet Uttrykksprogrammer transcriptional forskrifts oppnås ved koordinert endringer i chromatin struktur via ulike transkripsjon faktorer og co faktorer handlinger. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en verdifull molekylærbiologi tilnærming for å undersøke rekruttering av disse faktorene DNA og profilering tilhørende endringene i det chromatin landskapet. Nøkkelfaktorer for suksess for ChIP eksperimenter inkluderer optimaliseringer crosslinking forhold og chromatin klippe konsistens gjennom forskjellige prøver, tilgjengeligheten av tilstrekkelig utgangsmaterialet, og, spesielt, kvaliteten av antistoffer. Når du utfører ChIP fra hele vev, det er også viktig å vurdere heterogenitet prøvene og optimalisere protokollen for å forbedre effektiviteten i kjerner isolasjon, med sistnevnte blir et spesielt følsomme skritt når du arbeider med fettvev grunn forhøyet lipid innholdet. Faktisk, molekylær isolasjon teknikker fra hele adipose depoter er komplisert ved tilstedeværelse av høye nivåer av triglyserider, og protokollene må være optimalisert for å øke mengden av chromatin isolasjon. Til slutt, når høy gjennomstrømming sekvensering utføres etter ChIP-DNA isolasjon, sekvensering dybden er avgjørende for å bestemme antall topper som oppdages trygt.
Her vi se arbeider standarder og generelle retningslinjer for ChIP-seq eksperimenter anbefalt av kode og modENCODE konsortier6 for beste praksis, og vi fokus på en detaljert beskrivelse av en protokollen optimert for ChIP-seq fra BAT. Beskrevet protokollen tillater effektiv isolasjon av chromatin fra fettvev utføre genomet hele sekvensering for DNA-bindende faktorer med veldefinerte topper samt histone merker med mer diffus signaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her representerer et verdifullt verktøy for å utføre ChIP fra murine vev, spesielt optimalisert for brun fettvev. En av de større utfordringene i å utføre ChIP fra vev gjenoppretter et tilstrekkelig antall celler under eksempel forberedelse. Klipping balltre bruke en vev homogenizer blender kombinert med rustfritt stål perler i stedet for en kanoniske glass støter betydelig reduserer antall celler som er tapt på grunn av ubrutt vev. Videre hjelper homogenisere vevet direkte i en hypotonisk …
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
