Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino
Summary
Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.
Abstract
Processi più cellulari sono regolati dalla modulazione trascrizionale dei programmi di gene specifico. Tale modulazione è raggiunto attraverso l’azione combinata di una vasta gamma di fattori di trascrizione (TFs) e cofattori che mediano l’attivazione trascrizionale o repressione attraverso cambiamenti nella struttura della cromatina. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un approccio di biologia molecolare utili per la mappatura modificazioni istoniche e profilatura di fattori di trascrizione/cofattori vincolante al DNA, fornendo così un’istantanea dei cambiamenti nucleari dinamiche che si verificano durante diversi processi biologici.
Per studiare la regolazione trascrizionale nel tessuto adiposo, campioni provenienti da colture di cellule in vitro di immortalato o linee cellulari primarie sono spesso favorite nelle analisi di ChIP per l’abbondanza di materiale di partenza e ridotta variabilità biologica. Tuttavia, questi modelli rappresentano un’istantanea limitata dello stato effettivo della cromatina negli organismi viventi. Così, c’è un bisogno fondamentale per protocolli ottimizzati eseguire ChIP su campioni di tessuto adiposo derivati da modelli animali.
Qui descriviamo un protocollo per efficiente ChIP-seq di modificazioni istoniche e di proteine non istoniche in tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Il protocollo è ottimizzato per lo studio di genoma la localizzazione delle proteine di interesse e marcatori epigenetici nel pipistrello, che è un tessuto morfologicamente e fisiologicamente distinti tra i depositi di grasso.
Introduction
Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) è specializzato per accumulo di energia, il tessuto adiposo bruno (BAT) dissipa energia sotto forma di calore grazie alla sua capacità di convertire carboidrati e lipidi in energia termica tramite disgiungente mitocondriale1. A causa di questa funzione specializzata, il deposito BAT è necessario per il mantenimento della temperatura corporea in condizioni fisiologiche e in risposta all’esposizione fredda. Mentre i cambiamenti di espressione genica durante il differenziamento BAT e termogenico a stress sono stati studiati estesamente in vitro ed in vivo, i meccanismi molecolari alla base di questi cambiamenti sono stati principalmente dissecato in linee cellulari immortalizzate e primario pre-adipociti, con l’eccezione di diversi studi in vivo2,3,4,5.
Regolazione dei programmi di espressione genica specifica attraverso regolazione trascrizionale è ottenuta dai coordinati cambiamenti nella cromatina struttura tramite trascrizione vari fattori e co-fattori azioni. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un approccio di biologia molecolare prezioso per indagare il reclutamento di questi fattori per DNA e per profilare i cambiamenti collegati nel paesaggio della cromatina. Fattori chiave per il successo degli esperimenti di ChIP includono ottimizzazioni delle condizioni di reticolazione e cromatina tosatura uniformità tra i diversi campioni, disponibilità del materiale di partenza adeguato e, soprattutto, qualità degli anticorpi. Durante l’esecuzione di ChIP da tessuti tutta, è anche importante considerare la eterogeneità dei campioni e ottimizzare il protocollo per migliorare l’efficienza dell’isolamento di nuclei, con quest’ultimo essendo un passo particolarmente sensibile quando si lavora con il tessuto adiposo dovuto il contenuto di lipidi elevati. In realtà, tecniche di isolamento molecolare da depositi adiposi intero sono complicati dalla presenza di alti livelli di trigliceridi e protocolli devono essere ottimizzati per aumentare la quantità di isolamento della cromatina. Infine, quando sequenziamento ad alte prestazioni viene eseguita dopo l’isolamento di DNA-ChIP, la profondità di sequenziamento è fondamentale per determinare il numero di picchi che vengono rilevati con fiducia.
Qui, ci riferiamo agli standard di lavoro e linee guida generali per gli esperimenti di ChIP-seq consigliati da ENCODE e modENCODE consorzi6 per best practices, e ci concentriamo su una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato per ChIP-seq da BAT. Il protocollo descritto permette di eseguire il sequenziamento del genoma per fattori DNA-binding con picchi ben definiti, nonché marchi di istone con segnali più diffusi per efficiente isolamento della cromatina dal tessuto adiposo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui rappresenta un prezioso strumento per l’esecuzione di ChIP da tessuti murini, specificamente ottimizzati per tessuto adiposo marrone. Una delle maggiori sfide nell’esecuzione di ChIP da tessuto sta riprendendo un numero sufficiente di cellule durante la preparazione del campione. Taglio del blocco utilizzando un frullatore omogeneizzatore del tessuto accoppiato con perline in acciaio inox anziché un pestello di vetro canonico significativamente riduce il numero di cellule perdita a causa del …
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
