Kromatin Immunoprecipitation af Murine brunt fedtvæv
Summary
Her beskriver vi en protokol for effektiv kromatin immunoprecipitation (ChIP) efterfulgt af høj overførselshastighed DNA-sekventering (ChIP-seq) af brunt fedtvæv (BAT) isoleret fra en mus. Denne protokol er velegnet til både kortlægning Histon ændringer og undersøge genome-wide lokalisering af ikke-Histon proteiner af interesse in vivo.
Abstract
Mest cellulære processer er reguleret af transcriptional graduering af bestemte gen programmer. Sådan graduering er opnået gennem en bred vifte af transkriptionsfaktorer (TFs) og cofaktorer mægle transcriptional aktivering eller undertrykkelse via ændringer i kromatin struktur kombineret handlinger. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en nyttig Molekylærbiologi tilgang til kortlægning Histon ændringer og profilering transskription faktorer/cofaktorer binding til DNA, hvilket giver et øjebliksbillede af de dynamiske nukleare forandringer under forskellige biologiske processer.
For at studere transkriptionel regulering i fedtvæv, prøver stammer fra in vitro- cellekulturer af udødeliggjort eller primære cellelinjer er ofte foretrukket i ChIP assays på grund af overfloden af starter materiale og nedsat biologisk variation. Men disse modeller repræsenterer en begrænset øjebliksbillede af de faktiske kromatin stat i levende organismer. Således, der er et kritisk behov for optimerede protokoller til at udføre ChIP på fedtvæv prøver udledes fra dyremodeller.
Her beskriver vi en protokol for effektiv ChIP-FF. i både Histon ændringer og ikke-Histon proteinerne i brunt fedtvæv (BAT) isoleret fra en mus. Protokollen er optimeret for at undersøge genome-wide lokalisering af proteiner af interesse og epigenetiske markører i BAT, som er en morfologisk og fysiologisk forskellige væv blandt fedt depoter.
Introduction
Mens hvidt fedtvæv (WAT) er specialiseret for energilagring, afleder brunt fedtvæv (BAT) energi i form af varme på grund af dens evne til at omdanne kulhydrater og lipider til termisk energi via mitokondrie frakobling1. På grund af denne specialiserede funktion er BAT depot påkrævet til vedligeholdelse af kropstemperaturen i fysiologiske forhold og som svar til koldt eksponering. Mens gen expression ændringer i BAT differentiering og termogeniske stress har været grundigt undersøgt in vivo og in vitro-, har de molekylære mekanismer bag disse ændringer været mest dissekeret i udødeliggjort cellelinjer og primære før adipocytter, med undtagelse af flere in vivo-undersøgelser2,3,4,5.
Regulering af bestemte gen expression programmer gennem transkriptionel regulering er opnået ved koordineret ændringer i kromatin struktur via forskellige transskription faktorer og co faktorer handlinger. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en værdifuld Molekylærbiologi tilgang for at undersøge ansættelse af disse faktorer til DNA og til profilering de tilknyttede ændringer i kromatin landskab. Nøglefaktorer for succes af ChIP eksperimenter omfatter optimeringer af crosslinking betingelser og kromatin klipning sammenhæng i hele forskellige prøver, tilgængelighed af tilstrækkelig råvare, og, især, kvaliteten af antistoffer. Når du udfører ChIP fra hele væv, det er også vigtigt at overveje heterogenitet af prøverne og optimere protokol for at forbedre effektiviteten af kerner isolation, med sidstnævnte at være et særligt følsomme skridt, når du arbejder med fedtvæv skyldes forhøjet lipid indhold. I virkeligheden, Molekylær isolation teknikker fra hele fedt depoter er kompliceret af tilstedeværelsen af høje niveauer af triglycerider og protokoller skal optimeres for at øge mængden af kromatin isolation. Endelig, når høj overførselshastighed sekventering udføres efter ChIP-DNA isoleret, sekventering dybde er afgørende for fastsættelsen af antallet af toppe, der opdages trygt.
Her henviser vi til arbejdsstandarder og generelle retningslinjer for ChIP-seq eksperimenter anbefalet af den INDKODE og modENCODE konsortier6 for bedste praksis, og vi fokuserer på en trinvis beskrivelse af en protokol optimeret til ChIP-seq fra BAT. Den beskrevne protokol giver mulighed for effektiv isolering af kromatin fra fedtvæv at foretage genome-wide sekventering af DNA-bindende faktorer med veldefinerede toppe samt Histon mærker med mere diffuse signaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her repræsenterer et værdifuldt redskab til at udføre ChIP fra murine væv, specielt optimeret til brunt fedtvæv. En af de større udfordringer i at udføre ChIP fra væv er at inddrive et tilstrækkeligt antal celler under forberedelse af prøver. Klipning BAT ved hjælp af en væv homogeniseringsapparat blender kombineret med rustfrit stål perler i stedet for en kanonisk glas pistil betydeligt reducerer antallet celler tabt på grund af ubrudt væv. Derudover hjælper homogenisering væv dire…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
