小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀
Summary
在这里, 我们描述了有效染色质免疫沉淀 (chip) 的协议, 然后是从小鼠身上分离出的棕色脂肪组织 (bat) 的高通量 dna 测序 (chip-seq)。该方案既适用于组蛋白修饰的映射, 也适用于研究感兴趣的非组蛋白在体内的全基因组定位。
Abstract
大多数细胞过程是由特定基因程序的转录调控来调节的。这种调制是通过广泛的转录因子 (tf) 和辅因子的联合作用来通过染色质结构的变化介导转录激活或抑制来实现的。染色质免疫沉淀 (chip) 是一种有用的分子生物学方法, 用于绘制组蛋白修饰和分析转录因子与 dna 结合的方法, 从而提供了不同过程中发生的动态核变化的快照。生物过程。
为了研究脂肪组织中的转录调控, 从永生或原代细胞系的体外细胞培养中提取的样本往往受到 chip 检测的青睐, 因为起始材料丰富, 生物变异性降低。然而, 这些模型代表了生物体实际染色质状态的有限快照。因此, 迫切需要优化的协议, 以便对从动物模型中提取的脂肪组织样本执行 chip。
在这里, 我们描述了从小鼠身上分离出的棕色脂肪组织 (bat) 中有效的组蛋白修饰和非组蛋白的 chip-seq 方案。该方案经过优化, 用于研究 bat 中感兴趣的蛋白质和表观遗传标记的全基因组定位, bat 是脂肪仓库中形态和生理上不同的组织。
Introduction
虽然白色脂肪组织 (wat) 是专门用于储能的, 但棕色脂肪组织 (bat) 由于能够通过线粒体解耦1将碳水化合物和脂质转化为热能,以热的形式耗散能量。由于这种专门的功能, 最佳可得技术仓库需要在生理条件下保持体温, 并对冷暴露作出反应。虽然在 bat 分化过程中和热源应激作用下的基因表达变化在体内和体外得到了广泛的研究, 但这些变化背后的分子机制大多在永生细胞系和原代细胞系中被剖析脂肪前细胞, 除了几种体内研究2,3,4,5。
通过转录调控特定基因表达程序的调控是通过不同转录因子和共因作用协调改变染色质结构来实现的。染色质免疫沉淀 (chip) 是一种有价值的分子生物学方法, 用于调查这些因子在 dna 中的吸收情况, 并分析染色质景观中的相关变化。chip 实验成功的关键因素包括在不同样品中优化交联条件和染色质剪切一致性, 提供足够的起始材料, 最显著的是抗体的质量。在从整个组织执行 chip 时, 还必须考虑样品的异质性, 并优化协议, 以提高细胞核分离的效率, 后者是在处理脂肪组织时特别敏感的一步, 因为脂质含量升高。事实上, 由于存在高水平的甘油三酯, 整个脂肪库的分子分离技术变得更加复杂, 必须优化协议以增加染色质分离的量。最后, 当在 chip-dna 分离后进行高通量测序时, 测序深度对于确定自信检测到的峰数至关重要。
在这里, 我们参考 encode 和 modencode 财团为最佳实践推荐的 chip-seq 实验的工作标准和一般准则, 我们重点介绍了从 bat 为 chip-seq 优化的协议的分步描述。所述协议允许从脂肪组织中有效分离染色质, 以便对具有明确定义的峰值和更漫反射信号的组蛋白标记的 dna 结合因子进行全基因组测序。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的协议是一个有价值的工具, 执行 chip 从小鼠组织, 专门针对棕色脂肪组织进行优化。在从组织中执行 chip 时面临的更大挑战之一是在样品制备过程中恢复足够数量的细胞。使用组织均质器搅拌机与不锈钢珠子代替规范的玻璃牙, 将 bat 剪切, 可显著减少因未破裂的组织而丢失的细胞数量。此外, 将组织直接在低渗缓冲液中均质, 有助于释放脂质, 然后通过高速离心轻松分离并从细胞核…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
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