إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول لكفاءة الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) تليها الفائق تسلسل الحمض النووي (الرقائق-seq) من الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. هذا البروتوكول مناسبة لكل رسم الخرائط هيستون التعديلات والتعريب على نطاق الجينوم من البروتينات غير هيستون لمصلحة فيفو فيالتحقيق.
Abstract
وينظم عمليات الخلوية الأكثر النسخي تحوير الجينات محددة البرامج. ويتحقق هذا التعديل من خلال الإجراءات المشتركة لمجموعة واسعة من عوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة في التوسط للتنشيط النسخي أو القمع عن طريق التغييرات في هيكل الكروماتين. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج مفيدة في مجال بيولوجيا الجزيئية لرسم الخرائط التعديلات هيستون والتنميط النسخ العوامل/العوامل المساعدة ملزمة للحمض النووي، وبالتالي توفير لقطة من التغيرات النووية الدينامية التي تحدث خلال مختلف العمليات البيولوجية.
دراسة تنظيم النسخي في الأنسجة الدهنية والعينات المستمدة من الثقافات الخلايا في المختبر لتخليد أو خطوط الخلايا الأولية هي غالباً ما يفضل في رقاقة فحوصات بسبب وفرة ابتداء من المواد وتقليل التنوع البيولوجي. ومع ذلك، تمثل هذه النماذج لقطة محدودة للدولة الكروماتين الفعلية في الكائنات الحية. ومن ثم، هناك حاجة ماسة للبروتوكولات الأمثل لأداء رقاقة على عينات الأنسجة الدهنية المستمدة من النماذج الحيوانية.
هنا يصف لنا بروتوكول ل seq رقاقة كفاءة التعديلات هيستون والبروتينات غير هستون في الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. البروتوكول هو الأمثل للتحقيق في التعريب على نطاق الجينوم من البروتينات للفائدة وعلامات جينية في الخفافيش، التي مستقلة شكلياً وفسيولوجيا أنسجة بين مستودعات الدهون.
Introduction
الأنسجة الدهنية براون (BAT) بينما الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) المتخصصة لتخزين الطاقة، تبدد الطاقة في شكل حرارة نظراً لقدرته على تحويل الكربوهيدرات والدهون إلى طاقة حرارية عن طريق يفصل المتقدرية1. بسبب هذه الوظيفة المتخصصة، ومستودع التقنيات المطلوبة للمحافظة على درجة حرارة الجسم في الظروف الفسيولوجية واستجابة للتعرض للبرد. في حين قد درست التغيرات التعبير الجيني أثناء تمايز الخفافيش وعند الإجهاد حرارة على نطاق واسع في الحية وفي المختبر، الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه التغيرات كانت معظمها تشريح في خطوط الخلايا مخلدة والابتدائي adipocytes المسبق، باستثناء عدة الدراسات المجراة في2،،،من34،5.
تنظيم برامج تعبير الجينات المحددة من خلال تنظيم النسخي يتحقق عن طريق التغييرات المنسقة في الكروماتين الهيكل عن طريق النسخ مختلف العوامل واشتركت عوامل الإجراءات. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج قيمة بيولوجيا الجزيئية للتحقيق في توظيف هذه العوامل للحمض النووي والتنميط يرتبط بها من التغيرات في المناظر الطبيعية الكروماتين. وتشمل العوامل الرئيسية لنجاح تجارب رقاقة أمثل الظروف crosslinking واتساق القص الكروماتين في أنحاء مختلفة من العينات، توافر انطلاق المادية، والكافية، وأبرزها نوعية الأجسام المضادة. عند أداء رقاقة من الأنسجة كاملة، من المهم أيضا النظر في عدم تجانس العينات وتحسين البروتوكول تحسين كفاءة العزل النوى، ومع هذا الأخير يجري خطوة حساسة بشكل خاص عند العمل مع الأنسجة الدهنية نظراً محتوى الدهون مرتفعة. في الواقع، التقنيات الجزيئية العزلة من مستودعات كله الدهنية تتعقد بسبب وجود مستويات عالية من الدهون الثلاثية، وبروتوكولات يجب أن يكون الأمثل لزيادة مقدار عزل الكروماتين. وأخيراً، عندما يتم إجراء تسلسل الفائق بعد عزلة رقاقة الحمض النووي، عمق التسلسل أمر حاسم لتحديد عدد القمم التي يتم الكشف عنها بثقة.
هنا، نود أن نشير إلى أن معايير العمل والمبادئ التوجيهية العامة للتجارب رقاقة seq الذي أوصت به ترميز ومودينكودي اتحادات6 لأفضل الممارسات، ونحن نركز على وصف خطوة بخطوة لبروتوكول الأمثل ل seq رقاقة من الخفافيش. يسمح البروتوكول وصف لكفاءة عزل الكروماتين من الأنسجة الدهنية لإجراء تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة للحمض النووي–ربط العوامل مع قمم محددة تحديداً جيدا، فضلا عن علامات هستون بإشارات أكثر انتشارا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمثل البروتوكول الموصوفة هنا هي أداة قيمة لأداء رقاقة من الأنسجة مورين، وعلى وجه التحديد الأمثل للنسيج الدهني البنى. واحدة من أكبر التحديات في أداء رقاقة من الأنسجة يتعافى بعدد كاف من الخلايا أثناء إعداد عينة. القص بات استخدام خلاط الخالطون أنسجة مقترنة بحبات الفولاذ المقاوم للصدأ بدلا?…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Referências
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
