生成毛因诱导多能干细胞衍生的肿瘤抗原特异性胸腺移民的三维胸腺培养系统

所有动物实验均获得国家癌症研究所(NCI)机构动物护理和使用委员会的批准,并按照NIH指南进行。 1. 制备OP9/DLL1细胞,用于iPSC共培养 在 OP9 培养基培养性 OP9/DLL1 细胞 (β-最小必需介质 [+-MEM] = 20% 非热灭活胎儿牛血清 [FBS] = 1x 青霉素-链霉素 + 抗坏血酸 [50 纳克/mL] 和单硫甘醇 [100 nM]) 在 37 °C)。当OP9/DLL1细胞达到80~95%的汇合性时,用1倍镁、钙和酚红不含磷酸缓冲盐水(以下简称PBS)洗涤一次。 加入4 mL 0.05%胰蛋白酶,在37°C下孵育5分钟。然后加入4 mL的OP9介质,通过移液分离细胞层,使单个细胞悬浮。 通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中。在300 x g下在4°C下离心5分钟,吸出上清液,并在OP9介质的12 mL中重新悬浮。 将 OP9/DLL1 细胞悬浮液的 2 mL 板放在新的 10 厘米细胞培养培养皿上,并添加额外的 8 mL OP9 介质。每 2~3 天重复一次。注:FBS 的质量和培养条件对于保持 OP9/DLL1 细胞的扩张而不失去支持 iPSC 分化的能力至关重要。因此,建议在80%的汇合度下对FBS和通道进行预先评估,以防止细胞分化和衰老。制造足够的OP9/DLL1细胞冷冻库存,每4~6周解冻一次新库存也很重要。 2. iPSC在体外分化为不成熟T细胞 第 0 天,开始 OP9/DLL1 汇盘中的 iPSC 共同培养。 通过胰蛋白酶化(在37°C下5分钟在0.05%胰蛋白酶),收集iPSC作为单细胞悬浮液,收集细胞,并在300 x g下在4°C下离心5分钟。 以 OP9 介质每 10 mL 的 1.0 x 105 iPSC 吸气和重新悬浮细胞。将 1.0 x 105 iPSC 盘盘放在可汇 OP9/DLL1 10 厘米盘上。注:OP9/DLL1 10 cm 的菜肴在达到 90–100% 汇合时用于 iPSC 分化。汇合性的差异会影响 iPSC 分化的效率。 第 3 天,吸出旧介质,并更换 10 mL 的新鲜 OP9 介质。 第6天,通道细胞。 用 10 mL 的 PBS 清洗每个 10 厘米的汇联 OP9 盘。每道菜加入3 mL 0.05%的胰蛋白酶,在室温(RT)下孵育3~5分钟。 加入4 mL的OP9介质,通过温和的移液收集细胞。在4°C下,将细胞通过100μm细胞滤网,在300 x g下离心5分钟。丢弃上清液。 将细胞重新悬浮在10 mL的分化介质中(OP9介质与5 ng/mL鼠标Flt3配体 [FLT3L] 和 5 ng/mL 小鼠 IL-7)和板细胞悬浮液悬浮到新的 10 cm OP9/DLL1 汇盘中。 第 9 天,吸出旧介质,并更换 10 mL 的新鲜分化介质。 第11天,在iPSC菌落中观察到心肌细胞,通过移液机械分离非粘附细胞,并通过100μm细胞滤网过滤。在 4°C 下以 300 x g旋转 5 分钟。 吸出上清液,并在24 mL的分化介质中重新悬浮。将 iPSC 板盘放入汇入 OP9/DLL1 6 孔板(4 mL/孔)。 第15天,收集所有非粘附细胞,并通过40μm细胞滤网过滤。 在 4°C 下以 300 x g旋转 5 分钟。 通过重复步骤 2.5.1,每 3⁄4 天继续传递非粘附细胞。 3. 3D 胸腺培养,以生成 iTE 收获小鼠胎儿胸腺瓣和部署内源性淋巴细胞通过脱氧腺素(dGUO)治疗如前所述16。 在 dGUO 治疗的第 7 天,服用四个新的 10 厘米的菜肴,每个盘子都填充 20 mL 的完整介质(罗斯韦尔公园纪念研究所媒体 1640 [RPMI 1640] = 10% FBS = 1x L-阿兰尼-L-谷氨酰胺 + 1x 丙酸钠 = 1x 最小必需介质,含有非必需氨基酸(MEM-NEAA) = 1x 青霉素-链霉素 = [1:1000] 2-梅尔卡托乙醇。 将所有带胸腺瓣的硝基纤维素膜转移到一个10厘米的盘中。用钳子将单个叶从膜上分离,使其浸入介质中。丢弃膜。在 RT 孵育 1 小时。 将胸腺瓣转移到带有完整介质的 10 厘米新盘,并在 RT 孵育 1 小时。 使用钳子,将胸腺瓣固定在盘子上(一次一个),另一只手在中心进行100~200μm深切口,并延伸叶瓣直径的一半,以方便T细胞祖进体迁移到叶中。 将胸腺瓣转移到一个新的10厘米的培养皿中,里面装满了完整的分化介质(完整的介质 = 5 纳克/mL 鼠标 IL-7 = 5 ng/mL 鼠标 FLT3L = 5 纳克/mL SCF)。 或者,如果使用具有较低和上层网格的 3D 培养板,请用无菌 PBS 填充两个网格,以防止悬挂液的蒸发和干燥。 将包含一个 dGuo 处理胸腺瓣的完整介质的 30 μL 从步骤 3.6 转移到 3D 培养板的每个孔中。 从 OP9/DLL1 共培养(第 16-21 天)收集非粘附 T 系系细胞(iPSC 衍生未成熟 T 细胞),并在每 20 μL 介质中以 2⁄5 x 103 T系骨细胞重新悬浮。 在 3D 培养板中的每个胸腺瓣中加入 20 μL 的 T 系系细胞悬浮液。在37°C下孵育过夜,CO2为5%。 将 P200 移液器设置为 30 μL,并在从每个井中移液几次后吸出介质,以去除胸腺瓣周围的所有细胞。丢弃介质并添加 30 μL 的完整介质。重复此过程 5~7 次,取出任何未迁移到叶的超脱 T 细胞。之后每天更换 25-30 μL 的介质。 通过光显微镜,确认从第 4-5 天开始,在叶周围形成 iPSC 衍生胸腺移民 (iTE) 的光环。 每天通过移液介质收集 iTE,而不会造成叶瓣中断。每天更换介质,并继续收集约 12 天。 收获的iTE可用于分子分析(图2,图3,图4,图5)或体内移植实验。 4. 抗原呈现细胞的制备(APC) 牺牲一个C57BL/6鼠标通过宫颈错位,并放置在实验室浸泡垫上,如上所述。 取出脾脏,并将其放在100μm细胞过滤器上。使用 12 mL 注射器柱塞将脾脏压缩到滤网上,使单个细胞悬浮。 通过无菌的40μm细胞过滤器转移细胞悬浮液。在300 x g下将悬浮液在4°C下离心5分钟,以颗粒细胞。 吸出上清液,在2 mL氯化铵-钾(ACK)赖沙缓冲液中重新悬浮细胞颗粒,以排除红血球(RBC)。在 RT 孵育 5 分钟。 通过添加 10 mL 的 PBS 来淬火 ACK 解液缓冲液。在4°C下,在300 x g下通过离心将细胞进行5分钟的离心。 吸出上清液,将细胞颗粒重新悬浮在10 mL的完整培养基中,并转移到10厘米无菌培养皿中。 使用辐照装置(β-辐射)用3500 rad照射孢子,以防止细胞增殖。 立即将辐照细胞返回到37°C培养箱,并在一夜之间培养。 使用辐照细胞作为APC或冻结在细胞银行家。 5. 用抗原脉冲APC 使用 Neubauer 细胞测定仪和锥蓝色染料计数活辐照 APC。在37°C下用肽(hgp100)或核蛋白孵育APC30分钟。 用10 mL的PBS清洗APC两次,以去除任何额外的肽。 在 100 IU IL-2 和 5 ng/mL IL-7 的完整介质中,以 1:1 的比例计算 iTE 并与 APC 混合。将100μL的细胞混合物(总浓度:1 x 106细胞/mL)放入超低附件U底部96孔板的每口孔中,并在37°C下培养48小时。 48小时后,使用多通道移液器将细胞转移到新板,此后每2~3天通过一次。 在第3天,通过用细胞内抗体染色来分析细胞因子分泌物,并通过流动细胞学进行分析(图3)。 加入0.67μL/mL的蛋白质运输抑制剂(例如GolgiStop),在37°C孵育6小时,以增强细胞因子的细胞内积累。用 10 mL 的 PBS 清洗。 在3 mL的冷(4°C)PBS中重新悬浮细胞,并缓慢加入1 mL的4%甲醛(PFA)溶液。 10分钟后,在300 x g下旋转细胞5分钟,在4°C下,丢弃上清液,用10mL的PBS清洗。 在 1 mL PBS + 1% FBS = 0.1% 非离子表面活性剂中重新悬浮细胞,并在 4°C 中放置 10-15 分钟。 添加抗体,保护样品免受光线照射,并在4°C中放置30分钟。 在300 x g下旋转细胞5分钟,在4°C下,丢弃上清液,用10mL的PBS清洗。 在300 x g下在4°C下将细胞旋转5分钟,并在1mL的PBS中重新悬浮细胞。细胞已准备好在流动细胞仪中进行分析。