מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים
Summary
כאן, אנו מתארים שיטות של מניפולציה אלקטרואופטיקה של סוגים מסוימים של נוירונים במהלך ניטור של שינה/ערנות מדינות בעכברים, הצגת העבודה האחרונה שלנו על גרעין המיטה של מסוף הניסטריה כדוגמה.
Abstract
בשנים האחרונות, אלקטרואופטיקה היתה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר נוירודעי. במקרים רבים, opsin, כמו ערוץ הרודוסין 2 (ChR2), מבוטא על ידי וקטור וירוס בסוג מסוים של תאים עצביים בעכברים שונים של מנהלי התקנים. ההפעלה של opsins אלה מופעלת על ידי יישום של פולסים אור אשר מועברים על ידי לייזר או LED באמצעות כבלים אופטיים, ואת ההשפעה של ההפעלה היא נצפתה עם רזולוציה גבוהה מאוד. ניסויים מסוגלים לעורר בחריפות את הנוירונים תוך ניטור התנהגות או תוצאה פיזיולוגית אחרת בעכברים. אלקטרואופטיקה יכולה לאפשר אסטרטגיות שימושיות להערכת תפקוד של מעגלים עצביים בוויסות מצבי שינה/ערנות בעכברים. כאן אנו מתארים טכניקה לבדיקת ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהות כימית ספציפית במהלך אלקטרונצלגרם (EEG) ו אלקטרומגנט (EMG) ניטור כדי להעריך את שלב השינה של עכברים. כדוגמה, אנו מתארים מניפולציה של הנוירונים GABAergic בגרעין המיטה של מסוף הניסטריה (BNST). הריגוש האופגנטי אקוטי של נוירונים אלה מעורר מעבר מהיר לערות כאשר מיושם במהלך שינה NREM. מניפולציה אלקטרואופטיקה יחד עם הקלטת EEG/EMG יכול להיות מיושם כדי לפענח את המעגלים העצביים כי להסדיר שינה/ערות מדינות.
Introduction
שינה חיונית לתפקוד קוגניטיבי אופטימלי. הממצאים האחרונים גם מראים כי הפרעות בשינה משויכים מגוון רחב של מחלות1,2,3. למרות שפונקציות השינה הן עדיין לא פתורות, התקדמות משמעותית נעשתה לאחרונה בהבנת מעגלים עצביים ומנגנונים השולטים שינה/ערנות מדינות4. ביונקים, ישנם שלושה מצבי דריכות: ערות, התנועה לא מהירה העין (NREM) לישון, ואת העין מהירה תנועה (REM) לישון. ערות מאופיין בתנודות מהירות של EEG (5-12 Hz) של משרעת נמוכה עם פעילות מוטורית מהירה ומתמשכת. שינה NREM מוגדר על ידי תנודות איטיות (1-4 Hz) של משרעת גבוהה (גלי דלתא), עם חוסר הכרה ופעילות מוטורית תכליתי. שינה REM מתאפיינת בתנודות מהירות יחסית (6-12 Hz) של משרעת נמוכה וכמעט מוחלטת של שריר דו צדדי atonia5.
Borbely הציע תאוריה של התקנה שינה-ערות המכונה 2 תהליך הדגם6,7. תהליך הומסטטי, המכונה גם תהליך S, מייצג לחץ שינה המצטבר במהלך הערות ומתמוסס במהלך השינה. תהליך נוסף, המכונה תהליך C, הוא תהליך מעגלי, מה שמסביר מדוע רמות הדריכות משתנים במחזוריות של 24 שעות. בנוסף לשני תהליכים אלה, גורמים allostatic חשובים גם לוויסות שינה/ערות8,9. גורמים אלוסטטיים כוללים מצבים תזונתיים ורגשות. פחד וחרדה מלווים בדרך כלל על ידי עלייה בהתעוררות יחד עם תגובות אוטונומיות ונוירואנדוקרינים10,11,12. המערכת הלימבית הוא האמין לשחק תפקיד בוויסות של פחד וחרדה, ומנגנונים בבסיס התגובות האוטונומית האנדוקריניים נחקרו בהרחבה, אבל את השביל שבו המערכת הלימבית משפיע שינה/ערנות מדינות לא עדיין נחשף. מספר רב של מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות opto-ו פרמקוגנטיקה הציעו כי נוירונים ומעגלים עצביים להסדיר שינה/ערות מדינות מופצים ברחבי המוח, כולל את מערבולות, בסיס המוח הקדמי, תלמוס, ההיפותלמוס, וגזע המוח. בפרט, פיתוחים אחרונים באלקטרואופטיקה אפשרו לנו לעורר או לעכב מעגלים עצביים ספציפיים in vivo עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהה. טכניקה זו תאפשר התקדמות ההבנה שלנו של מצעים עצביים של שינה וערות, וכיצד שינה/הערות מדינות מוסדר על ידי תהליכים מעגליות, לחץ שינה, וגורמים allostatic, כולל רגש. נייר זה נועד להציג כיצד להשתמש מניפולציה אלקטרואופטיקה בשילוב עם הקלטת שינה/התעוררות, אשר יכול להיות הפוטנציאל לעדכן את ההבנה שלנו של התחברות ומנגנונים במוח כי לשחק תפקיד בוויסות NREM לישון, ראם לישון, וערות. הבנה של מנגנון זה שבו המערכת הלימבית מסדיר מדינות שינה/ערנות היא בעלת חשיבות עליונה לבריאות, כי נדודי שינה קשורה בדרך כלל עם חרדה או פחד להיות מסוגל לישון (somniphobia).
הוא נחשב לתפקיד חיוני בחרדה ובפחד. גד 67-הבעת הנוירונים הם אוכלוסייה מרכזית של הבנסט12,13. בדקנו את ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של הנוירונים האלה (נגבה בידיndt) על מדינות שינה/ערות. אחת ההתקדמות הגדולה ביותר במדעי המוח בשנים האחרונות הייתה שיטות המאפשרות מניפולציה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות בvivo, עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהות. אלקטרואופטיקה היא שימושית מאוד להפגין קשרים סיבתי בין פעילות עצבית ותגובות התנהגותיות מסוימות14. אנו מתארים אלקטרואופטיקה כשיטה לבחון את הקישוריות הפונקציונלית של מעגלים עצביים מוגדרים בוויסות מצבי שינה/ערנות. באמצעות שימוש בטכניקה זו, הושגה התקדמות רבה בהבנת המעגלים העצביים המוסתים שינה/ערות מדינות15,16,17,18,19 . במקרים רבים, opsins מוצגים במיוחד נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות באזורי המוח סלקטיבי על ידי שילוב של עכברים מנהל ההתקן והמין-inducible AAV-תיווך העברה גנטית. יתרה מזאת, ביטוי ממוקד של האופינים הרגישים לתמונה כגון המתקשרים 2 (ChR2)20 או הארכדופסין (archt)21 בשילוב עם מערכת מסוג-loxp או Flp-frt מאפשר לנו לתמרן אוכלוסיה עצבית סלקטיבית וספציפית . מסלול עצבי22
אנו מתארים כאן ניסויים על הנוירונים… כדי לבטא את האופינים באוכלוסיה עצבית ייעודית, עכברים מתאימים למנהלי התקנים של מנהלי ההתקנים ודרכי הווירוסים תלויי-היצור שבשימוש תכוף ביותר. שורות העברה או הקפאה, שבהן מתבטאת האופשות באוכלוסיות נוירואליות מסוימות, הן גם שימושיות. בניסויים הבאים, השתמשנו GAD67-יצורים טוק-in עכברים23 שבו רק gabaergic הנוירונים אקספרס היצורים RECOMBINASE עם רקע גנטי C57BL/6j, ו וקטור aav אשר מכיל ChR2 (hChR2 H134R) התמזגו עם eyfp או eyfp כפקד בבורר “FLEx (היפוך כריתה)”24. הנוהל מתאר במפורש את העירור האפגנטי של הנוירונים האחרים ב-BNST במהלך הניטור של מדינות שינה/ערות25.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו כאן הציגו שיטה כדי להעריך את ההשפעה של גירוי אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות על מעברים מדינה של שינה/ערות והעניק דוגמה של מניפולציה של הנוירונים בע. הנתונים שלנו הראו כי השפעת השפעת הנוירונים באופן מיידי על ידי הנירע באמצעות מעבר מיידית מ-nrem לישון לערות….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי התוכנית לימודים לחוקר מרק (54843), KAKENHI גרנט-עזרה עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים, “WillDynamics” (16H06401) (ט), ו KAKENHI גרנט ב-עזרה למחקר מחקרי בתחומים חדשניים (ט) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
Referências
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
