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Bioquímica

Soluzione di strutture della proteina fluorescente Cerulean utilizzando MeshAndCollect

Published: March 19, 2019
doi:
10.3791/58594
, , , , , , , ,
1European Synchrotron Radiation Facility,Structural Biology Group, 2European Molecular Biology Laboratory, 3Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS (Institut de Biologie Structurale)

Summary

Presentiamo l’uso del protocollo MeshAndCollect per ottenere un set di dati di diffrazione completa, per uso nella determinazione della struttura successivi, composto da set di dati di diffrazione parziale raccolti da molti piccoli cristalli della proteina fluorescente Cerulean.

Abstract

Cristallografia a raggi x è la tecnica principale utilizzata per ottenere informazioni di alta risoluzione concernente le strutture 3-dimensionale delle macromolecole biologiche. Fino a poco tempo, un requisito importante è stata la disponibilità di relativamente grandi, ben diffracting cristalli, che spesso sono difficili da ottenere. Tuttavia, l’avvento della cristallografia seriale e un Rinascimento in metodi di raccolta dati multi-cristallino ha fatto sì che la disponibilità di grandi cristalli non devono più essere un fattore limitante. Qui, vi illustriamo l’utilizzo del protocollo MeshAndCollect automatizzato, che identifica innanzitutto le posizioni di molti piccoli cristalli montati su supporto del campione stesso e quindi dirige la collezione dai cristalli di una serie di insiemi di dati di diffrazione parziale per la fusione successiva e uso nella determinazione della struttura. MeshAndCollect può essere applicato a qualsiasi tipo di micro-cristalli, anche se debolmente diffracting. Ad esempio, presentiamo qui l’uso della tecnica per risolvere la struttura di cristallo della Cerulean ciano proteina fluorescente (CFP).

Introduction

Cristallografia macromolecolare (MX) è, di gran lunga il metodo più utilizzato per comprendere le strutture tridimensionali delle macromolecole biologiche risoluzione atomica. Tuttavia, un collo di bottiglia più importanti è il requisito per cristalli relativamente grandi, ben diffrangano.

Spesso e in particolare quando la cristallizzazione di proteine di membrana, possono essere ottenuti solo molto piccoli cristalli di pochi micron di dimensione più grande. Danno da radiazione effetti limite la risoluzione un completo dei dati di diffrazione che possa essere raccolti da un singolo cristallo micro2e molto spesso, è necessario migliorare il rapporto segnale-rumore e quindi dati impostare risoluzione, fondendo diversi insiemi di dati di diffrazione parziale da cristalli diversi, ma isomorfi. Gli aumenti nella densità di cambiamento continuo di fasci di raggi x presso sincrotroni e altrove (ad esempio elettroni liberi a raggi x (X-FELs) laser), hanno fatto sì che insiemi di dati di diffrazione parziale utili possono essere raccolti da cristalli anche molto piccoli del biologico macromolecole. Questo, a sua volta, ha portato allo sviluppo di nuove tecniche per la raccolta e l’Unione di insiemi di dati di diffrazione parziale raccolti da molti cristalli diversi al fine di produrre un set di dati completo per la soluzione della struttura. Tali tecniche sono comunemente come seriale cristallografia (SX)3,4,5,6,7,8. Un esempio prototipo di SX è l’uso di dispositivi di iniettore per introdurre un flusso stretto di un impasto di cristallo nei raggi x larghezza3,4,5. Un reticolo di diffrazione viene registrato ogni volta che un cristallo è esposto ai raggi x che conduce alla raccolta, da molte migliaia di singoli cristalli, di ‘ancora’ immagini di diffrazione, informazioni che viene unita a produrre un set di dati completo. Tuttavia, un notevole svantaggio di questo tipo di raccolta dei dati seriale è che l’elaborazione di immagini fisse può essere problematico. La qualità dei dati è notevolmente migliorata se cristalli possono essere ruotati e/o diverse immagini di diffrazione sono raccolti dal cristallo stesso durante gli esperimenti di cristallografia seriale6.

MeshAndCollect1 è stato sviluppato con l’obiettivo di coniugare SX con collezione di dati di rotazione MX ‘standard’ e permette, in modo automatico, sperimentatori di raccogliere set di dati di diffrazione parziale da numerosi cristalli dello stesso bersaglio macromolecolare montato sui portacampioni uguali o diversi. Un set di dati di diffrazione completa viene quindi ottenuto unendo il più isomorfa dei set parziale di dati raccolti. MeshAndCollect è compatibile con qualsiasi beamline di raggi x di sincrotrone di state-of-the-art per MX (idealmente un impianto di dispositivo di inserimento con un relativamente piccolo (20 µm o meno) larghezza dimensioni in corrispondenza della posizione del campione). Oltre alla compilazione dei set completi di dati da una serie di cristalli piccoli, ben diffrangano, il metodo è anche molto adatto per la valutazione sperimentale iniziale della qualità diffrazione di micro-cristalli e per il trattamento dei campioni opachi, ad esempio, in meso cresciuta microcristalli di membrana proteine9.

All’inizio di un esperimento di MeshAndCollect, le posizioni, in due dimensioni, di ciascuno dei molti cristallo contenuta in un supporto singolo campione sono determinate utilizzando una scansione a raggi x di bassa dose. Le immagini di diffrazione raccolte durante questa scansione automaticamente vengono analizzate dal programma DOZOR1, che ordina le posizioni dei cristalli il supporto del campione secondo la loro forza rispettiva diffrazione. Posizioni per la raccolta di set di dati parziali vengono assegnati automaticamente in base a un cut-off forza di diffrazione e, nell’ultimo passaggio, piccoli cunei di dati di diffrazione, tipicamente ± 5 ° di rotazione, vengono raccolti da ogni posizione scelta. L’esperienza ha dimostrato che questa gamma di rotazione fornisce una quantità sufficiente di riflessioni al cristallo per set di dati parziale ridimensionamento fini, mentre allo stesso tempo, ridurre i problemi di centraggio di cristallo possibili e la possibilità di esporre più cristalli in un 1di supporto particolarmente affollate. Le zeppe di dati di diffrazione individuali (serie di dati parziali) sono quindi trattati sia manualmente o utilizzando l’elaborazione automatica dei dati e condutture10,11,12,13. Per la determinazione della struttura a valle quindi è necessario trovare la migliore combinazione di set di dati parziali per essere unite14,15,16 dopo che l’intero set di dati risultante può essere trattato nello stesso modo come uno che proviene da un cristallo singolo esperimento.

Come esempio di MeshAndCollect in pratica, vi presentiamo qui la soluzione della struttura cristallina di Cerulean la ciano proteina fluorescente (CFP), utilizzando un set di dati di diffrazione costruito dalla combinazione di parziale insiemi di dati raccolti da una serie di microcristalli montato sul supporto del campione stesso. Celestopoli sono stato progettato da verde fluorescente Protein (GFP) dalla Medusa Aequorea victoria17, cui cromoforo fluorescente autocatalytically è formata dalla ciclizzazione dei tre consecutivi dell’amminoacido residui. Celestopoli sono ottenuta da GFP mutando i residui primi e la secondo il cromoforo, Serina e tirosina, treonina (S65T) e triptofano (Y66W) rispettivamente e adattando l’ambiente cromoforo con ulteriori mutazioni (Y145A, N146I, H148D, M153T e V163A) per produrre un livello significativo, ancora non ottimale di fluorescenza di QY = 0.4918,19,20. Le proprietà fluorescenti suboptimale di Cerulean sono state proposte per essere legata alle dinamiche di proteina complessa che coinvolge la stabilizzazione imperfetta di una delle undici β-fili della proteina21 e per la sistemazione di due differenti cromoforo isomeri a seconda del pH e irradiazione condizioni22. Abbiamo scelto di lavorare con Cerulean come proteina modello che illustrano l’utilizzo del protocollo MeshAndCollect a causa del relativamente facilità di sintonizzazione cristallo dimensione a seconda della cristallizzazione. La struttura di Cerulean è molto simile a che della sua proteina di padre GFP è costituito di un β-barilotto formata da undici β-fili che circondano un α-elica, che porta il cromoforo.

Protocol

1. espressione e purificazione di Cerulean Nota: Questo è basato sul protocollo pubblicato da Lelimousin et al. 21 Esprimere la sua etichetta Cerulean in Escherichia coli BL21 cellule coltivate a 37 ° C in 4 L di auto viscoelastico medio23 fino OD600= 1 e quindi incubare per una notte a 27 ° C. Raccogliere le cellule batteriche a 5.000 x g e lisare le cellule tramite sonicazione (40%, 5 min, 10 impulsi s, 10 s pausa) in 200 mL di tampone costituito da 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl e 1 x privo di EDTA inibitori della proteasi. Caricare il surnatante in una colonna di sua trappola Ni-NTA ed eluire Cerulean con imidazolo 100 mM nelle stesse condizioni di buffer. Piscina le frazioni di colore gialle brillante. La proteina è intrinsecamente colorata, quindi le frazioni contenenti Cerulean sono facilmente distinguibili. Purificare la proteina (4 mL) in una colonna di S75 in 20 millimetri Tris pH 8.0. Piscina le frazioni di gialle brillante e concentrare la soluzione della proteina a 15 mg/mL. 2. cristallizzazione Utilizzare goccia d’attaccatura del vapore diffusione tecnica24 a 20 ° C nelle piastre di Linbro. Riempire i pozzetti con 1 mL di una soluzione precipitante composta da 100 mM HEPES pH 6,75, 12% PEG8000 e 100 mM MgCl2. Per le gocce d’attaccatura, mescolare 1 µ l di proteina concentrata a 15 mg/mL con 1 µ l di soluzione precipitante. Cristalli dovrebbero apparire in 24h. Raccolto i cristalli ottenuti e trasferimento a 100 µ l di un buffer di semina composto da 0,1 M a pH HEPES 6.75, 22% PEG 8000. Macinare i cristalli con una smerigliatrice di tessuto di 0,1 mL e diluire in semina buffer (rapporto 1: 100). Digerire un’aliquota della soluzione stock (15 mg/mL) della proteina con tripsina (0,5 mg/mL nello stesso buffer) per 1 h (01:10 (v/v)). Miscelare la soluzione di proteine digerite con 10% di semi-contenente tampone (v/v). Crescere cristalli (10 * 10 * 20 µm3) a 0,1 M a pH HEPES 7, 14% PEG 8000, 0,1 MgCl2 in sospensione di 1-1.5 μL gocce utilizzando il metodo di diffusione del vapore. 3. Crystal montaggio Utilizzare un ciclo adatto, ad esempio, un fori quadrati di maglia ciclo 700 di 25 µm ogni montato su una colonna vertebrale campione standard porta25. Trasferire cristalli dalla goccia di cristallizzazione (passo 2,6) in 1 µ l di soluzione di crioprotettore (la soluzione precipitante ben mescolata con glicerolo (finale 20% v/v)). Montare il liquame di cristallo della proteina su un loop di maglia spostando il ciclo sotto i cristalli e sollevandoli dalla goccia. Idealmente i cristalli dovrebbero essere nell’intervallo di dimensioni di 5 µm – 30 µm nella dimensione massima senza sovrapposizioni tra cristalli montati nel ciclo. Stoppino fuori il liquido in eccesso, toccando il Monte rapidamente con la carta da filtro. Sedimenti i cristalli che si siedono sul piano del ciclo circondato da poco liquido massa possibile. Tuffatevi sul Monte un unipuck pieno di azoto liquido. Memorizzare il puck a 100 K in un contenitore adatto fino a tempo del fascio è disponibile. 4. offline preparazione dell’esperimento sincrotrone Nota: Richiedere tempo fascio sincrotrone il più presto possibile e seguire le istruzioni online per i tipi di accesso disponibili e su come presentare una domanda per un determinato sincrotrone. Le linee guida ESRF possono essere trovate alla http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Se un membro di un gruppo di allocazione blocco ESRF (borsa), un’applicazione per ogni progetto specifico non è necessaria. In questo caso gli sperimentatori dovrebbero avvicinarsi loro responsabile borsa riguardanti la programmazione del tempo di larghezza. Dopo la proposta è accettata e viene ricevuto un invito per l’esperimento, hanno tutti i partecipanti di completare la formazione sulla sicurezza. Compilare il “A-form” (tramite il portale utente ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) con le informazioni di sicurezza richiesti sui campioni. Contattare il referente locale per discutere l’esperimento. Una volta che il vostro un-forma è presentata e convalidato vi darà il numero di esperimento e la password. Connettersi a estesa ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) e scegliere MX. Effettuare il login con il numero di esperimento e la password da un-forma. Selezionare spedizione | Aggiungi nuovo e compilare le informazioni richieste. Selezionare Aggiungi pacco e compilare i dati pertinenti. Selezionare Aggiungi Container, scegliere un unipuck e compilare le informazioni richieste, incluse le posizioni dei titolari del campione nel puck. 5. caricamento del campione su una Beamline Nel hutch sperimentale, caricare il puck in autocampionatore (SC) dewar e nota la sua posizione. La cabina sperimentale di interblocco e immettere il hutch di controllo. Login per il ISPyB (https://esrf.fr/). Selezionare Preparare esperimento, trovare la spedizione, selezionare Avanti e indicare la beamline e la posizione di puck in SC. Accedere al software di controllo beamline, qui MXCuBE227,28 con il numero sperimentale e la password forniti su un-forma. Premete Sync per sincronizzare il software di controllo beamline con il database di ISPyB. Utilizzare il software di controllo beamline, per montare il supporto del campione sul goniometro. In MXCuBE2, una posizione nell’area campione changer fare clic destro e selezionare Monte campione. Approfittando del MK3 Mini-kappa goniometro29 installato al massimo di beamlines l’ESRF MX, uso “visual riallineamento” flusso di lavoro30 di MXCuBE2 per allineare il piano di supporto del campione con l’asse di rotazione del goniometro. Selezionare il pulsante di centro , quindi 3-fare clic su centro al centro del bordo della punta del ciclo. Salvare la posizione concentrata selezionando Salva. Fare nuovamente clic sul pulsante centro , quindi 3-fare clic su centro metà dell’inizio del gambo del ciclo. Salvare la seconda posizione anche facendo clic su Salva. Selezionare uno dei salvati centrato posizioni facendo clic su di esso. In Avanzate, è possibile aggiungere il flusso di lavoro Visual riorientamento per la coda della raccolta dati MxCuBE2. Avviare il flusso di lavoro facendo clic su raccogliere coda. Dopo il flusso di lavoro consente di allineare il piano di supporto del campione con l’asse di rotazione del goniometro, centro il portacampioni nuovamente, questa volta da qualche parte nel mezzo della mesh. Orientare il supporto del campione in modo che la faccia della mesh è perpendicolare alla direzione del fascio di raggi x ruotando l’asse di omega utilizzando MXCuBE2. In MXCuBE2, selezionare la dimensione di larghezza richiesta per la scansione del supporto del campione (solo per beamlines con dimensioni del fascio variabile). Fare clic su apertura a discesa menu nel software di controllo della beamline e selezionare un valore, ad esempio, 10 µm. Definire una mesh per l’analisi di rete. Fare clic sull’icona dello strumento mesh in MXCuBE2. Verrà visualizzata la finestra di strumento di maglia. Secondo il campione di MXCuBE2, disegnare la maglia da sinistra cliccando e trascinando il mouse sopra l’area contenente cristalli il supporto del campione. Per salvare la rete fare clic sul pulsante Plus nella finestra degli strumenti di rete (mesh diventa verde). 6. preparare ed eseguire il flusso di lavoro MeshAndCollect Nel campo risoluzione di MXCuBE2, Inserisci la risoluzione (dmin) alle quali diffrazione immagini devono essere raccolti, ad esempio, qui 1.8 Å. Selezionare MeshAndCollect nella scheda di raccolta dati Avanzate , aggiungerlo alla coda e fare clic su raccogliere la coda. Nella finestra del parametro che viene visualizzata, utilizzare i parametri di default dipendente beamline. Nell’esperimento descritto qui impostazioni predefinite sono parametri 0.037 s tempo di esposizione al punto di scansione di rete, 100% di trasmissione (che in questo caso 4 x 1011 ph/s), 1 ° oscillazione per linea di scansione di rete. Fare clic su Continua. Viene eseguita la scansione di rete e le immagini di diffrazione raccolte in ogni punto della griglia sono analizzate e classificate secondo forza di diffrazione con il software DOZOR1. Questo processo viene eseguito in background. Dopo l’analisi DOZOR viene generata una mappa termica e l’ordine per le raccolte di dati parziali successivi viene assegnato automaticamente in base alla forza di diffrazione (Vedi Figura 1).Nota: I risultati di questo passaggio possono essere ispezionati anche in ISPyB. Per la raccolta di set di dati parziali, che una nuova scheda con le impostazioni si apre il software di controllo beamline, selezionare i valori adatti per la gamma di rotazione (cioè 0,1 °), numero di immagini (ad esempio, 100), tempo di esposizione, ad alta risoluzione e trasmissione, inversa fascio ecc idealmente la dose per ogni Cuneo essere raccolti dovrebbe essere inferiore al limite di Garman (30 MGy). Il tempo di esposizione approssimativa per immagine è 0.037 s a 0.1 s in condizioni sperimentali descritte. Fare clic su continua per avviare le raccolte di dati parziali. 7. trattamento dei dati Nota: I set di dati parziali sono integrati con un programma adeguato (XDS10). Per questo sarà essere usato uno script Python che riconosce ogni set di dati singoli, integra e fa in modo che l’indicizzazione tra i diversi insiemi di dati parziali è coerenza. Aprire la cartella contenente le immagini: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean. Eseguire una copia di sicurezza della sottocartella processo che può essere trovata nella cartella dove sono raccolti i set di dati parziali. Sul terminale Linux, utilizzare il comando cp-r process_backup di processo. Spostarsi nella cartella processo e lanciare lo script di elaborazione. Sul terminale Linux, digitare il comando cd processo e premere INVIO. Tipo procMultiCrystalData e premere INVIO.Nota: Lo script chiederà per un gruppo di spazio e i parametri delle cellule (questa informazione è facoltativa), immettere quelli secondo le istruzioni. Dopo un’ultima conferma dell’utente, lo script verrà eseguito automaticamente. 8. l’Unione di insiemi di dati Nota: Dopo che tutti i set di dati parziali sono integrati la migliore combinazione di loro vengono uniti per produrre il set finale di dati per uso nella determinazione della struttura e la raffinatezza. Diverse finalità di questo processo di fusione può essere per ottenere piena completezza (altamente consigliato), alta molteplicità o le migliori statistiche di dati (alta , R-fattori di Bassi, ecc.). Quest’ultimo può talvolta essere a scapito della completezza e/o molteplicità, così questa opzione dovrebbe essere scelto con cura. Unire i set di dati parziali utilizzando il programma ccCluster14. Utilizza Hierarchical Cluster Analysis (HCA) per determinare le possibili combinazioni di isomorfe insiemi di dati parziali (). Digitare ccCluster nel terminale Unix per aprire l’interfaccia utente grafica (GUI).Nota: Nella GUI di ccCluster un dendrogramma viene disegnato. Questo dà un suggerimento su quale set di dati parziale potrebbe risultare migliore Unito basato su isomorfismo tra di loro. Fare clic su un nodo che corrisponde a un valore di circa 0.4 sull’asse verticale. In genere, i valori più alti includerà dati più parziali di moda portare ma in peggio l’Unione statistiche come serie di dati parziali saranno meno isomorfe. Fare clic su Unisci dati. Il cluster selezionato saranno trattati in background e le statistiche di fusione stimate apparirà in una nuova scheda nella GUI. Questo passaggio può essere ripetuto per diverse combinazioni di insiemi di dati. Per una buona combinazione di serie di dati parziali la completezza dovrebbe essere vicino al 100%, valori elevati (10 o superiore in shell risoluzione minima) e i valori di31 R-meas bassa (circa il 5% in shell bassa risoluzione). Per ogni combinazione selezionata è possibile utilizzare lo script di input generato per unire i set di dati parziali scelti in un file di singolo mtz (cioè, inutile32). Definitivamente in scala e unire i dati di intensità in questo file utilizzando un programma di ridimensionamento (cioè, aimless32) e, come con un file proveniente da una raccolta di dati di cristallo singolo, utilizzare l’uscita per successive phasing e soluzione di strutture33 .

Representative Results

MeshAndCollect, come è implementato in MXCuBE2 (Vedi Figura 1A), è stato utilizzato per la raccolta di set di dati di diffrazione parziale da piccoli cristalli di Cerulean situate allo stesso titolare di campione in cui era difficile identificazione visiva dei cristalli. Per schermare il portacampioni, abbiamo disegnato una griglia sopra il centro della meshloop (cfr. Figura 1B) e basato sul DOZOR Punteggio calore mappa 85 diffrazione parziale (Vedi figure 1, 1D), insiemi di dati sono stati raccolti automaticamente. Questi sono stati integrati individualmente poi fusa (Vedi sopra) per produrre un set di dati con completezza di 99.8% a dmin = 1.7Å (cfr. tabella 1). Correlazione di metà-set (CC1/2)34 in shell più alta risoluzione era 60% (= 4,7). Come previsto, la struttura di cristallo di Cerulean poteva essere risolto semplicemente con sostituzione molecolare33 utilizzando il set di dati generato. Dopo un affinamento, abbiamo ottenuto un Rlavoro del 22,8% e un Rgratuito del 25,4%. Sovrapposizione con la struttura determinata in precedenza (PDB ingresso 2WSO21) Mostra un rmsd globale sulle posizioniα C 0.1 Å. Statistiche del set di dati risultante Soglia di clustering 0.35 Numero di dataset parziale 25 Gruppo spaziale P212121 Cella unitaria (a, b, c) 50,98, 62,76, 69.50 Gamma di risoluzioni 46,58-1.70 (1,73-1,70) Rmerge (tutti I + e -) 0,133 (0.743) Rmeas (tutte le ho + & ho-) 0.142 (0,813) RPIM (tutti ho + & ho-) 0,047 (0,318) Osservazioni totale/unico 220693/25129 Mean((I)/SD(I)) 13.8 (4,7) Correlazione di metà-set MN(I) CC(1/2) 0,994 (0,602) Completezza 99.8 (99,5) Molteplicità 8.8 (6,5) Finale Rcryst 22,8 Finale Rgratis 25.4 Tabella 1: Statistiche del set di dati risultante che indica l’alta qualità dei dati raccolti. Figura 1: utilizzo di MeshAndCollect per raccogliere una serie di set di dati parziale da una serie di piccoli cristalli contenuti nel supporto del campione stesso. A) l’interfaccia utente di MXCuBE2. L’ovale verde sopra il campo sull’asse visualizzatore indica lo strumento griglia. B) con esso viene disegnata una griglia sull’immagine del supporto del campione nel campo immagine di vita. Mappa di C) calore dei punteggi DOZOR. D) esempio di un’immagine di diffrazione. E) dendrogramma dopo analisi dei cluster gerarchica. Insiemi di dati in rosso sono stati utilizzati per l’Unione. F) struttura del Cerulean. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il successo di un esperimento di MX dipende solitamente l’esistenza di relativamente grandi, ben diffracting cristalli. Per i progetti cui ottimizzazione da docce piccolo cristallo a cristalli più grandi non riesce, MeshAndCollect fornisce una possibilità per ottenere un set di dati di diffrazione completa per struttura soluzione tramite la combinazione dei set di dati parziale isomorfe raccolti da una serie di piccoli cristalli. Il metodo è compatibile con sincrotrone beamlines per MX, idealmente con un flusso di fotoni ad alta e un piccolo fascio di diametro, dotato di un dispositivo di diffrattometro d’avanguardia e un rilevatore di lettura veloce. Su una stazione di fine, la parte di raccolta di dati di tale esperimento porterà circa 20 minuti, a seconda del numero di serie di dati parziali per essere raccolti e il numero di cristallo contenenti supporti del campione da analizzare.

La condizione più importante per il successo di un esperimento di MeshAndCollect è l’esistenza di un numero sufficiente (almeno 50, 100 idealmente) di diffracting posizioni il supporto del campione. Dall’esperienza, la dimensione minima dei cristalli da analizzare deve essere circa 5 µm nella dimensione più piccola. Il metodo è compatibile con qualsiasi tipo di standard compatibile cryo-raffreddamento del campione titolari con i migliori risultati raggiunti utilizzando mesh monti che sono rigide e dritto.

Presso l’ESRF, MeshAndCollect viene implementata in modo user-friendly in un flusso di lavoro Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en)30 disponibile nel software di controllo beamline MXCuBE2. Dei principali vantaggi di MeshAndCollect rispetto ad altri metodi SX è che i dati raccolti possono essere elaborati da programmi standard e automatizzata di tubazioni utilizzate per singolo cristallo MX.

Come dimostra il nostro esempio, MeshAndCollect è molto facile da applicare e porta ad una serie di insiemi di dati di diffrazione parziale, solitamente raccolti da piccoli cristalli, che possono essere Uniti per produrre un set di dati completo per l’uso nella soluzione della struttura. Inoltre, MeshAndCollect ha il potenziale per aprire lo spazio di campionamento di cristallografia di proteine in quanto fornisce un modo per raccogliere dati utilizzabili dalle prove di cristallizzazione dove l’ultimo passaggio di ottimizzazione, la produzione di cristalli di grandi dimensioni, è riuscita.

Alla luce degli attuali sviluppi verso più luminosi sorgenti di raggi x (per esempio, estremamente brillante fonte (EBS) progetto/ESRF35) è prevedibile che a causa di danno da radiazione aumentata, il tipo di raccolta di dati multi-cristallo facilitato da MeshAndCollect diventerà il metodo standard di raccolta di dati, piuttosto che un’eccezione – come è attualmente il caso – a base di sincrotrone beamlines MX.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo l’ESRF per fornire tempi di fascio attraverso il suo programma di ricerca interna.

Materials

Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
aimless MRC Laboratory of Molecular Biology Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
XDS Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)
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Referências

  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Bioquímica. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Bioquímica. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. . Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution?. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 – 2022). The orange book. , (2015).

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Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).
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