Роман объект признание и расположение объекта, поведенческое тестирование у мышей на бюджет

Этот протокол обеспечивает эффективный метод для проведения расположения объекта и Роман объект признание поведенческое тестирование у мышей. Эти тесты позволяют оценку гиппокампа функции, а также функции других корковых регионов, таких как префронтальной коры, участвующих в объект признание¹⁰. OLT и Норт имеют преимущество избежания раздражителей с сильным эмоциональным валентности, которые требуются для Моррис воды лабиринт, контекстная страх кондиционирования, Барнс лабиринт или Радиальный/консольный торцовочный лабиринт. Они также избежать необходимости лишения пищи в качестве необходимых для Радиальный/консольный торцовочный лабиринт. Кроме того этот протокол описывает простой процедуры тестирования два дня, которая не требует большой или сложной оборудования для выполнения или анализа. Один недостаток этих задач является, что они не предусматривают мер обучения или приобретения. Разница в новизна исследования может быть вызвано беднее изучение объектов во время обучения, бедных памяти за то, что узнал или оба. Общее время, затраченное расследование объектов является важной мерой для решения любых присущи различия в разведке диск, но не является мерой обучения. Если меры обучения имеют важное значение для экспериментальной вопрос, воды лабиринт, Барнс лабиринт, или Радиальный/консольный торцовочный лабиринт, вероятно, будет предпочтительнее.

Пользовательские здание поведенческих Аренас имеет потенциал, чтобы спасти сотни долларов и привести объект тестирования в пределах финансовых досягаемости широкий спектр лабораторий. Этот протокол устраняет множество препятствий и упрощает процесс изготовления сделать более доступным для ученых, без специализированной подготовки строительства собственных арены в акрил. Важно отметить, что покупка Цветные акриловые листы, которые будут контрастируют с мышей, таких как белый акрил для черный мышей и черная акриловые для белых мышей, облегчит сбор данных и анализ, особенно при использовании коммерчески доступных программное обеспечение для анализа. Заказ, вырезать по размеру листов с «перенаправленного края» устраняет необходимость для таблицы увидел (Таблица 1), и использование акрилового цемента удаляет необходимость бурения и зенковки отверстия. Завинчивание крепеж, сверление и резка акрила часто вызывает перерыв, чип и трещины из-за его хрупкий характер. Потому что цемент растворителя, он будет поступать в соединяемых районе, растворяя и смягчения любых акриловых он сталкивается. Таким образом она не применялось к каждой части отдельно как если бы это был традиционный клея. В отличие от клея цемент не будет заполнить негативных пространства или поверхностях. Это основная причина заказать «маршрутизируемых края», как это обеспечит гладкая и плоская края, создание гораздо лучше Бонд. Когда цемента высыхает, он будет слились две акриловые листы в один кусок в процессе, называемом «растворителя сварка». Как сварки металлов, готового продукта является цельного куска, но сварные области всегда будет оставаться слабым местоположение. Таким образом после того, как арены используются, следует избегать прямого воздействия или крайнего стресса в эти моменты.

Этот протокол также показывает, как настроить 4 арен для одновременного тестирования до 4 мышей (рис. 1 и рис. 2). Непрозрачные стены арены предотвратить мышей видеть друг друга во время тестирования, но все еще существует возможность того, что наличие других мышей в зале вызывает запах или шум отвлекает, которые могут повлиять на результаты тестирования. Привыкания испытания как подробную здесь может помочь смягчить эту проблему, как мышей подвергаются воздействию многих животных комнатных условий перед поведенческое тестирование. Однако если отвлекаться от других мышей или экспериментатор шум, связанный с обработкой других мышей сильную озабоченность, одна арена с одной мыши могут использоваться, а также, хотя это увеличит время, необходимое для завершения OLT и Северный с несколько мышей. Более чем 4 арены теоретически могли бы быть использованы также, но большинство камер не имеют достаточно широкое поле зрения чтобы показать, что многие аренах с хорошим разрешением.

Размеры и расстояния при условии, что здесь находятся общие руководящие принципы для мыши поведенческого тестирования в типичном зале тестирования, 16 x 16 x 16 м³ в измерениях (рис. 1B и 1 C). Настроить соответствующие экологические сигналы, арены и запись видео оборудования должны быть оптимизированы для каждой среды. Подсказки могут состоять из крупных форм или шаблонов (обычно в черный и белый), которые позволяют мышей пространственно ориентироваться во время OLT. Вместо размещения подсказки в разных местах друг напротив друга, подсказки также могут быть установлены на стенах области тестирования. Этот протокол рекомендует разделить тестирования комнате занавес, чтобы скрыть исследователь и компьютер в ходе поведенческого тестирования. Во время всех привыкания, интервалы между судебной и активных процессов исследователи должны закрыть занавес, чтобы отделить себя от зоны контроля. Если это не практический, компьютер может оставаться с учетом мышей, но исследователь должны перейти из поля зрения во время задачи. Если исследователь, мышей может попытаться полагаться на ей или ему как пространственные биток.

Все поведенческого тестирования должен быть завершен в условиях температуры и влажности с тусклым, но даже освещение на около 310 lux и минимальным посторонних звука или сильной экологической запах подсказки, например духи на экспериментаторов. Между каждый день судебного разбирательства и тестирования все арены и объекты должны быть очищены с животных фонда, Рекомендуемые методы стерилизации как протирка с 70% этанол или без запаха отбеливатель салфетки для сведения к минимуму обонятельные сигналы. Если используются химические Дезинфектанты, окончательное полоскание с 70% этанол рекомендуется, потому что многие химических дезинфицирующих средств может быть раздражающим для животных ноги.  Как с любой поведенческих задач, обработка мышей на несколько дней, прежде чем тестирование нужно ознакомить их с лицами, которые будут выполнять OLT и Норт и уменьшить стресс во время тестирования^20,22. Как мышей может испытывать острый стресс из-за незнакомых людей вблизи полигона, рекомендуется также, что все поведенческого тестирования должна быть завершена к же лицо. Тестирование параметров и условий, подробно изложены в настоящем протоколе были оптимизированы для 6-9 week-old взрослых мышей C57Bl/6 и будет наиболее полезной в выявлении нарушениями памяти из-за травмы в этой возрастной группе или нарушениями памяти из-за возраста сам в старых мышей. Если цель состоит в том, чтобы проверить для улучшения памяти в молодых мышей, больше ITI, начиная от 1 часа до 1 суток было бы более уместно избежать воздействия потолка на производительность в легче версии ITI 20 мин. Действительно ИТИС может варьироваться от 5 мин (для немедленного отозвания) до нескольких часов или дней (для удаленного воспоминания), в зависимости от конкретных потребностей эксперимент и штаммов и возрастов мышей. Важно отметить, что независимо от длины, все ИТИС должно быть согласовано между сессиями в эксперименте. Как различных штаммов и возрастов мышей демонстрируют различия в поведении и обучения, сроки для каждого судебного разбирательства и интервал, тестирование области договоренности, и используемые объекты могут быть изменены согласно конкретного штамма мышей, их возраст и конкретный ущерб / болезнь/вмешательство модель тестируется^9,21,23,25.

В то время как гиппокампа зависимость функции пространственной памяти испытания в OLT устоявшихся, Норт может или не может полагаться на гиппокамп. Интерпретация данных из Норт следует принять этот нюанс учетной записи. Определение переменных для ли участие гиппокампа, в объект признание памяти не согласованы еще, но могут включать ITI длины или значимости пространственными аллюзиями¹⁸. Примечательно представленные протокол использует пространственное OLT до Норт, который может исказить мышей к использованию гиппокампа процессов в Норт. Таким образом важно отметить, что порядок может быть отменено, или каждая задача может выполняться самостоятельно, в зависимости от экспериментаторов вопросы и потребности.

Выбор объектов является важнейшим аспектом OLT и Норт-^22,24. Идеальные объекты являются достаточно тяжелый, чтобы не быть легко перемещены с помощью мыши и изготовлены из материала, как стекло или металла, что мышь не может повредить, жевания или царапин. Деревянные, пены, или мягкие пластиковые объекты не подходят как они легко деформируются и трудно держать запаха. Кроме того объекты, используемые в исследованиях должны быть относительно аналогичных по размеру, текстура, запах и материала. Рисунок 1 d дает пример соответствующего объекта, который может быть использован. Это оранжевый пластиковая фигурка цыпленок с песком, чтобы придать ему достаточно веса и опечатаны для предотвращения утечки чистящих реагентов или другие агенты, вызывающие запах. Из-за формы верхней мышей способны подняться на верхней части или сидеть на этот объект. OLT или Норт этот объект лучше всего в паре с другим объектом аналогичного размера, веса, материала, цвета и сложности, как аналогичные пластиковая фигурка кролика. Чтобы убедиться, что объект расследования действительно отражает предпочтение новизны, все объекты должны быть проверены для эквивалентной ценности с минимум 8 мышей в том же напрягаться, пола и возраста экспериментальной группы как описано в разделе 2.9 Протокола. Кроме того объекты следует рандомизированных в терминах, которые объекта является объект роман или перемещении между мышей в том же исследовании для дальнейшего обеспечения что своиственные характеристики объектов не влияют на предпочтения. Размещение объекта может также сильно повлиять на успех или провал OLT и Норт. Объекты должны быть уравновешенным в аренах и не быть слишком близко к стенам. Угол, переполненном объектом является привлекательным местом для мышей, чтобы скрыть, и это будет смешивать меры расследования.

Важной предпосылкой для сбора данных является определение «активного расследования», которая, когда мышь участвует объект с его носом указал на объект от не более 2 см. Мышь двигаться над верхней части объекта или глядя мимо объекта не квалифицируются как активного расследования. Кроме того поскольку OLT и Норт зависят от мыши, вспоминая пространственного расположения или фактические особенности объекта, должны быть достаточно изучения этих во время подготовки судебных разбирательств. Таким образом исследователь должен определить время минимальный расследования и исключить любые предметы, которые не отвечают, что базовый уровень расследования, традиционно устанавливается на 20 секунд²¹.

Количественная оценка объектов расследования время может осуществляться различными способами, с или без дорогих анализа программного обеспечения. Если используется ручная биговка, как описано здесь, наиболее полный сбор данных может быть достиган записи отметки времени на видео, когда мышь изучает объект. Запись времени начала и остановки объектом расследования в ходе трех отдельных испытаний создает постоянный журнал объективное время марок и облегчает точное Вычисление вручную данных в отличие от альтернативных методов, например с помощью секундомер для аддитивно Запишите общее время мышь исследует каждый объект.

Коммерческие пакеты программного обеспечения также доступны для озвучивания объект расследования. Коммерчески доступное программное обеспечение может обеспечить большой объем данных за руку, озвучивание данных, описанных здесь, включая общее расстояние ездил, количество времени, проведенное в некоторых областях арены и скорость движения^16,23. Программное обеспечение, однажды правильно откалиброван и подтвердил надежно обнаружить объект расследования, могут также принести данные гораздо быстрее, чем ручная биговка. Это быстрее данных доходности в долгосрочной перспективе, может доходность чистая экономия по сравнению с человека часов, необходимых для ручная биговка. Однако большинство пакетов программного обеспечения для анализа поведения имеют высокие начальные расходы, которые могут быть непосильными для многих лабораторий и ручная биговка часто может быть достигнуто путем студент исследователей, делая почасовые затраты поведенческого скоринга минимальным. Коммерческое программное обеспечение также часто приходит с ограничениями на сколько пользователи могут получить доступ программного обеспечения одновременно, ограничение пропускной способности и времени сбережения данных. Хотя есть много преимуществ для этих пакетов программного обеспечения, они не являются необходимыми для сбора важной информации время расследования объекты из OLT и Норт. Возможность вручную приобретать эти данные делает Роман объект задачи более финансово доступным для более широкого круга исследователей.

Дополнительной функцией настоящего Протокола является, что первая сессия привыкание это по существу разбирательства в открытом поле, которое может принести данные о деятельности и уровень тревоги. Уровни активности могут быть количественно с помощью всего расстояния или средняя скорость, если отслеживание программного обеспечения доступен. Аналогичным образом с отслеживания программного обеспечения, меры тревоги могут быть получены от времени провел в центре арены или расстояния в центре. Эти данные могут также приобретаться вручную путем наложения видео Арена с сеткой и количественного определения пересечений. Это открытое поле данные могут помочь исключать валового мотор дефицита или чрезмерного беспокойства, которые могли бы помешать объект расследования позже.

Статистические тесты, используемые в настоящем Протоколе, представитель традиционных методов анализа. При сравнении 2 группы мышей, два образца, двустороннее t теста рекомендуется проверить значимость разницы в процент времени расследование объект перемещенный или роман между группами. Если размеры выборки распределяются неравномерно, имеют исключительно высокой изменчивости, или показать неравномерным изменчивость между группами, непараметрический тест рекомендуется вместо, как многие из основных посылок, t-теста будут нарушены в этих условиях. При сравнении 3 или более групп мышей, ANOVAs, рекомендуется проверить, имеет ли группа значительное влияние на процент времени расследование перемещенный или Роман объект. Исправлена ошибка пост hoc тесты, такие как Тьюки тест или исправлены Бонферрони попарных сравнений, затем могут применяться для проверки разница во времени процент расследования между каждой парой групп. С OLT дополнительный способ анализа данных — для проверки существенных изменений в процент времени расследование перемещенный объект от подготовки OLT испытания. С только одной группе мышей, этот тест будет принимать форму парных, двустороннее t тест, тестирование на значительные изменения в процент времени с перемещенного объекта от обучения в OLT в каждой мыши (имея в виду, что эти парные анализы и не независимой измерения, поскольку каждая мышь дает две точки данных). С двумя группами мышей, неоднократные меры, которые будут использоваться двусторонний ANOVA, с повторные измерения время судебного разбирательства (подготовка против OLT) и назначение группы, будучи вторым фактором. Пост hoc тесты для различия между группами лечения следует сравнить группы друг с другом в рамках судебных разбирательств.

В качестве альтернативы если доказательства памяти в OLT или Норт является все, что в настоящее время проверяется, может использоваться один образец t тест процент времени расследование объект против фиксированное значение 50%. Процент времени, значительно выше, чем 50% предлагает память для объекта. Процент времени значительно ниже 50% предлагает отвращение (по некоторым причинам), и выбор объекта должны быть пересмотрены. Однако один t тест не может выявить, отличаются ли две или более группы друг от друга. Например, в эксперименте с двумя группами мышей, если группа A провела 60% времени с новым объектом для p = 0,049 на один-t тест сравнения до 50% и Группа B только провел 59% из времени с новым объектом для p = 0,051 , Группа значительно отличается от 50% (а не группы B). Однако это ошибочно заключить, что эти две группы значительно отличаются друг от друга. Двухвыборочный t тест сравнение A и B можно легко выявить, что эти две группы статистически неотличимы. Если конечной целью является для сравнения производительности памяти двух или более групп, эти группы должны быть статистически по сравнению друг с другом, не только по сравнению с внешним стандартом. Аналогичные руководства применяется для сравнения времени с перемещенного объекта между профессиональной подготовкой и OLT. В этом случае найти значительная разница в процентах времени с перемещенного объекта между профессиональной подготовкой и Олт, в одной группе, а не в другой не показывают, что эти группы статистически отличаются. Группы должны быть пост hoc по сравнению друг против друга в течение каждого судебного разбирательства, не только через испытания в пределах группы.

Важно иметь в виду, что время расследование любых индивидуальных мышь не может использоваться в качестве доказательства за или против памяти. Скорее память для объекта местоположение или личность в выполнении этих задач можно заключить только основаны на статистических данных, которые статистически по сравнению с другой группы статистических данных или фиксированной шансы уровней (50% на время, 0 для дискриминации соотношение). Размер выборки необходимо будет сильно зависеть Размер эффекта особое манипуляции и изменчивости в поведении, оба из которых в свою очередь будет зависеть от используемого мышей. Возраст, пол и манипуляций все воздействия изменчивости. В примере данные, представленные в рисунке 3а и 3Б, n = 14 предметов были использованы, давая эффект размер 0,68 и мощь 0,65 для парных t тест с α = 0,05. Если мощность 0,8 были для этого сравнения, размер выборки 18 потребуется.

Эта дискуссия строится вокруг p значения и значение предохранители потому что эти меры и анализ наиболее обычно сообщили OLT и Норт данных и поэтому вероятно знакомы экспериментаторов и рецензентов. Эта зависимость p значения была подвергнута резкой критике как статистически недействительными²⁶. Однако хотя методы альтернативного анализа существуют и утверждаются в некоторых журналах²⁷, ни были широко приняты биомедицинских и поведенческих поля как стандартные²⁶.

Таким образом этот протокол испытаний эффективно памяти у мышей при минимальных затратах. Для обеспечения успешного осуществления с любой небольшой грызун модели включены рекомендации для соответствующих изменений к протоколу. Применение настоящего протокола к конкретным травм или терапевтического вмешательства модели можно выявить ценные функциональной релевантности, который дополняет изучаются механизмы клеточной и молекулярной.