(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University
Summary
両方符号化へと非コードを結合する蛋白質を識別するためにクリックして化学支援 RNA インタラクトーム キャプチャ (CARIC) 戦略を適用するための詳細なプロトコル、Rna が表示されます。
Abstract
RNA 結合タンパク質 (Rbp) の包括的な同定は、細胞の転写制御ネットワークを理解する鍵です。RBP キャプチャのため広く使用されている戦略を悪用、起こる [多] ターゲット Rna の正体不明 non-poly(A) Rna のほとんどの結合蛋白質を残して、真核生物の成熟 Mrna に大抵起こる。ここでクリックして化学支援 RNA インタラクトーム キャプチャ (CARIC) の代謝ラベリングを組み合わせることによりポリ a と non-poly(A) の両方の Rbp のトランスクリプトーム キャプチャを有効にすると呼ばれる最近報告された方法の詳細な手順を説明します。Rna は生体内でUV 架橋、bioorthogonal のタグ付け。
Introduction
様々 なタイプのコーディングおよび非翻訳 Rna (ncRNAs) Mrna、Rrna、Trna など、小さな核 Rna (目的)、核小体低分子 Rna (snoRNAs)、および長い非コード Rna (lncRNAs)1人間のゲノムを転写します。これらの Rna のほとんどは、Rbp の服を所有している、リボ核タンパク質粒子 (結合)2として機能します。したがって、Rbp の網羅的同定は、様々 な人間の病気3,4,5に関与する Rna と Rbp、間規制のネットワークを理解するための前提条件です。
過去数年間は、様々 な真核生物システム2,6、人間7,8,9,10,11, を含む発見 Rbp の大きな後押しを目撃しています。マウス12,13,14, 酵母9,15,16, ゼブラフィッシュ17,キイロショウジョウバエ18,19、線虫16、シロイヌナズナ20,21,22、および人間の寄生虫23,24,25.これらの進歩は、カステッロらによって開発された RBP 捕獲作戦によって促進されています。7 Baltzら2012生体内でUV 架橋 RNA と相互作用するタンパク質、Rna、ポリ a のランダムプライマー キャプチャおよび質量分析法 (MS) を組み合わせた8 -プロテオームのプロファイリングに基づきます。しかし、その多は大抵のみ ~ 3% % を占める – 5 真核生物のトランスクリプトーム26の成熟した mrna 発現に存在している事実を考えるとこの広く使用されている戦略はありません Rbp non-poly(A) Rna が、ほとんど ncRNAs を含むとの相互作用をキャプチャできます。Mrna。
ポリ a と non-poly(A) の両方の Rbp27のトランスクリプトーム捕獲のための最近開発された戦略の手順の詳細を報告する.CARIC と呼ばれる、この戦略は生体内でUV 架橋と (クリック反応に参加することができます bioorthogonal 機能グループを含んだ) 活性型と「クリック」のヌクレオシド アナログ、rna 代謝ラベリングを組み合わせた 4-thiouridine (4SU)、および 5-ethynyluridine (EU)。CARIC 戦略と理想的な結果を得るための鍵となる手順は、効率的な代謝ラベリング、UV 架橋・ クリック反応と RNA の整合性の維持です。Cu(I) クリック反応の触媒として使用される Rna の断片化が発生することができます、ため RNA 断片化を減らすことができる Cu(I) リガンドは不可欠です。我々 は RNA の劣化を引き起こすことがなくセル lysates の効率的なクリック反応を実行する方法について説明します。
RBP をキャプチャ、HeLa 細胞の同定のみこのプロトコルに記載されては、様々 な細胞タイプにして生物 CARIC 戦略を適用できます。RBP キャプチャ以外にもこのプロトコルはまた MS 試料調製とタンパク質の同定及び定量プロテオミクス実験に慣れていない人のために役立つことができる合理化されたステップバイ ステップの手順を提供します。
Protocol
注意: 該当する場合、使用する試薬が RNase フリー フォームで購入または RNase フリーで溶剤に溶解 (ピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) で、ほとんどの場合-処理水)。RNA のサンプルおよび RNase フリー試薬を処理する場合は常に手袋とマスクを着用、RNase の混入を避けるために頻繁にそれらを変更します。 1. のライセートの調製代謝ラベルと UV 架橋細胞 EU と 4SU…
Representative Results
品質管理手順の代表の結果が掲載されています。結果には、2.3.2 (図 1) の手順で説明されているゲルの蛍光分析、4.1.3 (図 2 a) の手順に従って西部のしみの分析と手順 4.2.2 (図 2 b) で説明した銀染色分析の数字が含まれます。品質管理の手順は、CARIC プロトコルの最適化のために重要です。品質管理は?…
Discussion
公正な RNA の整合性の維持は、CARIC 実験の成功へのキーの 1 つです。Cu(I) と慎重な作戦の適切な配位子、RNA の劣化が大幅に削減、部分的な低下が観察されたが。EU の実験サンプルに 4SU 置換率は、それぞれ 1.18% と 0.46% (データは示されていない)。2,000 の長さでそのまま Rna の nt、Rna の ~ 90% 含まれている少なくとも 1 つの EU と 1 つの 4SU。1,000 の長さに部分的に劣化した Rna の nt、Rna の ~ 70% 含…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立自然科学基礎の中国の助成金 91753206、21425204 と 21521003 とキーの研究と開発プロジェクト 2016YFA0501500 によってサポートされます。
Materials
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
| Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
| LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
| Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
Referências
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
- Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
- Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
- Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
- Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
- Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
- Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
- Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
- Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
- Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
- Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
- Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
- Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
- Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
- Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
- Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
- Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
- Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
- Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).
Citar este artigo
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).