Un modello di Mouse controllata per sepsi polimicrobica neonatale
Summary
Questo protocollo fornisce i passaggi necessari per stabilire e valutare il sepsis neonatale in 7 giorno-vecchi topi.
Abstract
Sepsis neonatale rimane un onere globale. È necessario un modello preclinico di interventi profilattici o terapeutici efficaci dello schermo. La sepsi polimicrobica neonatale del mouse può essere indotta iniettando cecal liquami intraperitonealmente nel giorno della vita 7 topi e loro monitoraggio per la settimana seguente. La procedura dettagliata necessaria per l’attuazione di questo modello di sepsi neonatale sono presentati qui. Questo include fare uno stock di liquame cecal omogeneo, diluirla per una dose di lettiera-regolato e di peso, una struttura del programma di monitoraggio e una definizione delle categorie di salute osservati utilizzato per definire gli endpoint humane. La generazione di uno stock di liquame cecal omogeneo da donatori pool permette l’amministrazione in molte cucciolate nel tempo, riducendo la variazione tra i donatori ed impedendo l’utilizzo di glicerolo potenzialmente tossico. La strategia di monitoraggio utilizzata consente l’anticipazione del risultato di sopravvivenza e l’identificazione dei topi che più tardi sarebbe progresso alla morte, consentendo un’identificazione precoce dell’endpoint humane. Due principali caratteristiche comportamentali vengono utilizzati per definire i punteggi di salute, vale a dire, la capacità dei topi neonatale a destra se stessi quando sono immessi sulla loro schiena e loro livello di mobilità. Questi criteri potenzialmente potrebbero essere applicati per indirizzare gli endpoint humane in altri studi della malattia neonatale nei topi, come uno studio pilota è effettuato per confermare la precisione. In conclusione, questo approccio fornisce un metodo standardizzato per il sepsis neonato modello nei topi, fornendo risorse per valutare il benessere degli animali utilizzati per definire endpoint precoce umano per animali sfidati.
Introduction
La sepsi è delle principali cause di decessi infettiva neonato umano1. Perché neonato sepsi sono capita male, scarsi progressi compiuti in entrambi l’identificazione dei neonati a rischio presto durante la malattia e lo sviluppo di trattamenti efficaci o profilassi. Ciò richiede l’uso di modelli animali di sepsi per comprendere meglio i processo e test possibili interventi. Inoltre, roditori adulti rispondono in modo diverso alla sepsi, con differenze statisticamente significative nel numero di batteri per amministrare per ottenere la stessa dose mortale (LD) e le differenze nella risposta dell’ospite risultante rispetto ai neonati2. Così, sepsi neonatale deve essere studiato in neonati. Diversi modelli di adulto sepsi sono stati utilizzati nella ricerca di sepsi. Questi includono una sfida endovenosa con specifici organismi implicati nella sepsi umano adulto o legatura e puntura cecal (CLP). CLP è un modello di endogeno sfida dove l’intestino cieco è chirurgicamente isolato, legato e forato per permettere la fuoriuscita del contenuto intestinale nel peritoneo, portando infine alla diffusione sistemica dei microbi e dei loro prodotti3. Tuttavia, la procedura chirurgica necessaria per stabilire CLP è letale per gli animali appena nati; Pertanto, un metodo alternativo è necessario di imitare la sfida polimicrobica della CLP per indurre sepsi neonatale. Il modello cecal liquami per sepsi polimicrobica neonatale è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza, per cui il contenuto cecale di animali è raccolte, sospesa in sterile di destrosio 5% in acqua (D5W) e iniettato intraperitonealmente in topi neonati2. Questo è, dal momento che, diventata un modello sempre più popolare per lo studio di sepsi negli animali sia neonati e adulti e sostanzialmente ha avanzato intuizioni meccanicistiche della malattia processo4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Dato il crescente utilizzo di questo modello e desiderio di ricercatori di confrontare direttamente i risultati in pubblicazioni, c’è una necessità per gli aspetti tecnici di essere ben descritti e standardizzati attraverso gli studi. Standardizzazione si applica a tre aspetti del modello, vale a dire, i) la preparazione del brodo cecal liquami, ii) la preparazione delle aliquote sfida per iniezione in animali da esperimento e iii) la definizione dell’endpoint umano per cui gli animali sono da considerarsi giormi negli esperimenti di sfida. In particolare, metodi per preparare il brodo di liquami cecal spesso viene fatto riferimento all’articolo originale introducendo il modello2. Un breve riassunto di quel modello è che contenuto cecale da topi adulti era raccolte, sospesa in D5W sterile ad una concentrazione di 80 mg/mL e utilizzato all’interno di 2 h per iniettare gli animali sperimentali. Questo modello originale usato i topi della stessa età, dalla stessa posizione di venditore, che sono stati alloggiati nelle proprie strutture di ricerca rispettivi per meno di 2 settimane prima della raccolta contenuto cecale. L’uso di topi cresciuti in casa, anche se riducendo il costo da fornitore regolare consegna e consentendo l’uso di topi in eccesso di una più vasta gamma di età e sesso, anche sostanzialmente aumentato donatore a donatore variabilità. Questo ha motivato lo sviluppo di una tecnica alternativa, per cui contenuto cecale da topi multipli sono stati riuniti insieme per preparare un grande magazzino, che era poi aliquotati e conservati a-80 ° C13. Questo metodo alternativo è stato adattato da più gruppi14,15. Tuttavia, tale adeguamento ha provocato alcune varianti tecniche, sia il supporto di memorizzazione utilizzato (10% o 15% glicerolo, o D5W da solo) e nella strategia di filtrazione per rimuovere il particolato (filtraggio multistadio attraverso un 860 µm e, quindi, un 190 µm filtro o individuo filtrazioni attraverso 100 µm o 70 µm filtri)13,14,15. L’iniezione di glicerolo da solo potrebbe potenzialmente causare danni, dato che le iniezioni di glicerolo di 25% – 50% sono state usate come un modello del roditore di lesione renale16,17,18,19, 20. Per evitare effetti collaterali indesiderati di glicerolo, la preparazione di impasti cecal liquami per topi in questo studio è congelata nel D5W senza glicerolo, e vengono eseguiti test di vitalità batterica da conservazione a-80 ° C. La strategia di filtrazione utilizzata in questo studio è un passaggio attraverso un filtro 70 µm, che direttamente non è stato paragonato ad altre strategie di filtrazione elencate.
Dosi letali di peso-regolato di liquami cecal iniettata possono variare da struttura a struttura e devono essere titolate fuori per la letalità desiderata per i singoli gruppi. Con le dosi differenti di sfida, i volumi di sfida accompagnamento cambiare dalla necessità. Tuttavia, questo dettaglio metodologico non è stato segnalato prima. Inoltre, strategie per le procedure standard, come ad esempio l’iniezione intraperitoneale, raramente sono elaborate all’interno della letteratura, ma tecniche individuali possono influenzare se topi neonati una perdita quando iniettato e loro risultati finali l’impatto.
Benessere degli animali, tra cui una definizione di endpoint umano, è un aspetto centrale di questo modello e in qualsiasi modello di infezione e infiammazione in roditori21. Nel 1998, il Consiglio canadese su cura (CCAC) ha pubblicato linee guida estese per selezione umana degli endpoint, definendo l’endpoint umano come “qualsiasi effettivo o potenziale dolore, angoscia o disagio dovrebbe essere ridotta a icona o alleviato scegliendo il più in anticipo endpoint che è compatibile con gli obiettivi scientifici della ricerca”22. Altri anche attenzione che deve essere stabilito humane endpoint basati sulla giustificazione scientifica, piuttosto che su un’interpretazione soggettiva dell’animale stato solo21. Mentre c’è una ricchezza di risorse per cliniche, comportamentali e ai criteri basati a segno corpo-condizione per endpoint umano, anche nel contesto dell’infezione e l’infiammazione in particolare21,23,24, nessuno di questi , compresi gli orientamenti CCAC per endpoint humane22, menzionare topi neonati. Così, oggettivamente e scientificamente giustificato humane endpoint sono molto più difficili da stabilire per animali appena nati, dato le loro limitate capacità comportamentali sia la mancanza di prove da criteri, quali la perdita di peso, che è comunemente usato per l’adulto topi. Attualmente, i criteri per l’endpoint umano utilizzato per 5 – a 12-giorno-vecchio topo neonato nella letteratura cecal liquami tutti fanno riferimento al manoscritto originale che ha introdotto il modello2. In questa carta originale, la definizione di endpoint humane per animali neonati era basata su due criteri; vale a dire, la posizione del mouse di fuori del nido (scattering) e la mancanza di macchie di latte era stato visto a causare la morte entro ore. Una questione che complica nell’assegnazione di un endpoint di tipo umano è che latte macchie diventano difficili da vedere in diversi ceppi di topi con pelliccia scura, come ad esempio il ceppo C57BL/6J comunemente impiegato, dopo la prima settimana di vita, mentre gli animali malati vengono monitorati fino al 14 ° giorno di vita (DOL). Ulteriori, morti animali possono trovare postchallenge quando si applicano questi criteri (il proprietario di osservazione; inedito); così, una definizione più rigorosa di endpoint umano è necessaria per alleviare le sofferenze agli animali da esperimento ed evitare la mortalità in situazioni dove il risultato potrebbe essere accuratamente individuato in precedenza.
Tutti i tre aspetti metodologici del modello cecal liquami sono presentati in una procedura operativa standard dettagliare la preparazione dello stock cecal liquami, un metodo per l’iniezione di animali da esperimento che mantiene la costante di volume di iniezione tra le dosi e riduce il rischio di perdite e una definizione di endpoint humane per 7 – a-giorno-topi di 12 basato su un sistema di modellazione comportamentale. Informazioni comportamentali dei punteggi di salute del mouse da oltre 240 animali da esperimento è stato raccolto e raggruppati per risultato finale di sopravvivenza, dimostrando una definizione basata su prove dell’endpoint humane. La sofferenza degli animali da esperimento è ridotto identificando moribondi topi neonatali nel punto più in anticipo di tempo possibile, mentre i risultati biologicamente significativo di sopravvivenza possono dedurre osservando le variabili chiave. La rappresentazione visiva di preparazione cecal liquami e di comportamenti del mouse neonatale servirà come una risorsa eccellente per qualsiasi gruppo studiando sepsi o sfida neonato modello animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Postnatali topi neonatali hanno molto limitato la mobilità e non riescono a se stessi a destra dopo essere stato messo sulla schiena, anche quando incontrastato. Da 7 DOL, l’età dei topi sfidati in questo modello, una gamma di movimento che spaziano dai diritti-Mobile a FTR-Mobile è stata osservata nei topi incontrastati, con una differenza importante, vale a dire che un mouse incontrastato a questa età non ha visualizzato il comportamento FTR-letargico. Sono stati osservati solo topi sfidati con sepsi polimicrobica diventare FTR-letargico; Pertanto, questa risposta può essere un indicatore della gravità della malattia. Essere attento per il taglio di un angolo di 90° dall’orizzontale per il movimento dell’anca consente l’assegnazione coerenza e preciso del movimento dell’anca letargico o mobile in topi. Il lasso di tempo di 4 s per vedere se un mouse può giusto per sé è stato selezionato perché incontrastati topi sono riusciti a destra costantemente se stessi entro questo lasso di tempo. Ripetuto la misura dello stesso mouse è stato evitato, mentre il tempo a destra se stessi e la misurazione della mobilità dell’anca è stata limitata a 4 s, per non affaticare eccessivamente il mouse, che altrimenti poteva influenzare la sua capacità di ottenere cibo e calore e poteva incidere sui suoi prognosi di stare meglio. Raddrizzamento sé da sinistra e destra sono stati osservati, e il più alto dei punteggi è stato utilizzato per determinare se il mouse è stato a un endpoint di tipo umano, perché alcuni topi sono stati trovati per visualizzare FTR-Nonmobile su un lato ancora hanno una maggiore mobilità da altro lato e b e in grado di recuperare alla fine.
Il sistema di punteggio utilizzato per valutare la salute del mouse invocata l’applicazione di tagli categorici a che cosa è una gamma di movimento e, di conseguenza, potrebbe essere soggetto a pregiudizi individuali. Il personale è stato addestrato insieme per garantire che ogni persona ha ottenuto i topi lo stesso; Tuttavia, probabilmente ci rimarrà un livello di soggettività che conduce alla variazione. La consistenza di punteggio è stata valutata avendo sette ricercatori che non avevano precedentemente effettuato il monitoraggio del mouse neonatale imparare i requisiti descritti in questo protocollo e video e, quindi, in modo indipendente assegnare comportamenti e determinare humane endpoint. Una precisione del 97% è stata osservata con il Punteggio effettuato su 60 topi sfidati, suggerendo che pregiudizi individuali non gioca un ruolo notevole nelle assegnazioni del comportamento di questo modello. Il protocollo di monitoraggio del comportamento presentato si basa su osservazioni di animali sfidati il DOL 7, ancora topi di età inferiore a 6 giorni in uno stato sano incontrastato costantemente non possono proprio essi stessi. Così, i criteri dell’endpoint umano descritto non potevano essere applicati direttamente ai più giovani topi. Se più giovani topi vengono utilizzati in questo modello sperimentale o se viene applicato un modello di sfida diversa con la cinetica di differenti di malattia, quindi i criteri dell’endpoint umano adatto devono essere sviluppati e pilotati per evitare l’eutanasia dei topi che sarebbe altrimenti, alla fine, recuperare. Il sistema di Punteggio Visualizza un metodo affidabile di migliorare la classificazione di endpoint umana che, con test e conferma, potenzialmente potrebbe essere applicato ad altri modelli.
Ogni preparazione di liquami cecal o l’uso di un nuovo ceppo del mouse necessaria la retitration della dose cecal liquami per amministrare per ottenere una simile dose letale. Ogni preparazione è stata standardizzata dalla lettura di interesse, vale a dire sopravvivenza, piuttosto che dare lo stesso conteggio batterico. Concentrazione batterica vitale di ogni preparazione liquami cecal variata leggermente, potenzialmente dovuto le differenze nei batteri commensali del donatore o a causa di variazioni del peso lasciato nel colino cella della postfiltration stock cecal liquami. Durante la titolazione del liquame cecal, le prime due cucciolate sono stati divisi in due gruppi e ogni metà della cucciolata sono stati sfidati con una delle due dosi, affinché ognuna delle dosi sarebbe stato testato in due cucciolate. Se il tasso di sopravvivenza risultante non corrisponde il livello richiesto, quindi la dose di sfida è stata aumentata o diminuita di 5-10% e l’esperimento ripetuto. Cucciolate multipli sono stati utilizzati per tenere conto delle differenze di cucciolata a cucciolata che potrebbero causare resistenza o aumentata suscettibilità alla sepsi attraverso una cucciolata. Era importante accuratamente titolo lo stock di liquami cecal con ogni nuova preparazione per garantire che la nuova titolazione del liquame cecal era paragonabile ai precedenti preparati cecal liquami. Periodi di rumore in eccesso e vibrazioni, in particolare durante la compattazione dell’asfalto e la costruzione di un edificio nelle vicinanze e la strada, sono stati osservati per aumentare lo sforzo nelle dighe. Questo correlato con i tassi aumentati di cannibalizzazione e colpite la mortalità degli esperimenti di sopravvivenza, anche che interessano topi incontrastati, indicando che ci può essere estranei impatti sulla sopravvivenza neonatale che anche bisogno di essere controllato per.
Metodi precedenti per preparazione impasti cecal liquami includevano l’impiego dei liquami cecal fresco o la preparazione di liquami cecal congelati, utilizzando una varietà di metodi, tra cui l’archiviazione in glicerolo che inevitabilmente verrebbero trasferito durante la sfida. Mentre l’impiego dei liquami cecal fresco fornisce il vantaggio di avere una composizione batterica più vicina ai contenuti cecali originali, c’è il rischio di varianza tra topi donatore individuale a causa della variazione di batteri commensali. Mentre questo è stato ridotto al minimo utilizzando cecali donatori dello stesso fornitore con un tempo minimo tra l’arrivo e la progressione dell’esperimento, questo potrebbe diventare un’opzione costo proibitivo per alcuni laboratori e ha presentato un’altra sfida logistica di temporizzazione nell’avere topi di pari età disponibili quando si inizia un impasto cecal esperimento in topi neonatali che erano vecchi di 7 giorni. È stato utilizzato un metodo alternativo all’utilizzo di liquami cecal fresco, dove contenuti cecal più adulto dei donatori sono stati riuniti, risospesi in D5W, congelati a-80 ° C senza glicerolo e scongelati un’aliquota a un tempo per gli esperimenti. L’utilizzazione dei liquami cecal donatori adulti studiare sepsis neonatale potenzialmente potrebbe trasferire la specie di batteri presenti nel liquame cecal che il mouse neonatale non è stato esposto a, ma è una strategia che consente lo studio di sepsis in topi neonatali e è stato utilizzato per studiare biologia del mouse neonatale nel passato13,14,15. Cecal liquami è stato diluito in D5W per fornire nutrimento per i batteri, che ha permesso l’istituzione di un’infezione attiva, una volta che i batteri sono stati iniettati ed è stato fatto per simulare la disponibilità di nutrienti nella cavità peritoneale durante necrotizzante enterocolite. Glicerolo non è stato incluso come un agente di stabilizzazione in batteri di congelamento a causa di potenziali effetti collaterali negativi che possono derivare da iniezione di glicerolo da solo. Se glicerolo era stato incluso nella preparazione cecal liquami, quindi i potenziali danni che glicerolo da solo potrebbe indurre avrebbe bisogno di essere testati per includendo una sola glicerolo (manca cecal liquami) iniezione in topi, che avrebbe aumentato mouse utilizzo. La vitalità di batteri delle scorte cecal liquami è stata testata dopo il congelamento lo stock di liquami cecal senza glicerolo ed è stata trovata per essere costante, con nessun cambiamento nella concentrazione di batteri in aliquote separate della stessa preparazione cecal liquami conservata a-80 ° C sopra un 6 periodo di mesi. Ciò suggerisce che il deposito senza glicerolo è fattibile nel fornire un coerenza risultato biologico. L’uso di una massa-preparato congelato stock cecal liquami anche permesso per l’uso di topi allevati in azienda, riducendo i costi e quindi utilizzando topi maschi che altrimenti sarebbero in eccesso da allevamento, riducendo gli sprechi del mouse.
L’identificazione delle sfide non riuscite in topi era importante evitare l’aggiunta di rumore supplementare al sistema. Dopo aver subito un’iniezione intraperitoneale di liquami cecal, i topi sono stati osservati per la presenza di un rigonfiamento sotto la pelle, che indicava un’iniezione fallito che era effettivamente sottocutaneo. Topi sono stati osservati per perdite al sito di iniezione, sia immediatamente dopo la rimozione dell’ago e dopo permettendo loro di fare un passo dopo l’iniezione, perché topi sarebbero a volte (raramente) una perdita solo dopo aver spostato la parte del sito di iniezione con un passo. La presenza di un rigonfiamento o perdita che segue l’iniezione ha provocato la rimozione del mouse dall’analisi. Dopo tutto, uno di questi potrebbe provocare un risultato diverso a causa della non corretta quantità di liquami cecal iniettato come una differenza di 5% in dose challenge è stata osservata per influenzare la sopravvivenza successiva.
Sfida di liquami cecal esperimenti spesso necessarie dosi letali di destinazione diverse con diverse dosi di peso-regolato. A causa di questo, i volumi di iniezione possono variare da appena 20 µ l e fino a 100 µ l. Errore sperimentale proporzionata associato con ago morto volume cambia anche con il volume di iniezione, aumentando la difficoltà per confrontare direttamente le dosi differenti. Con la semplice modifica di uniformare il volume di iniezione, questa fonte di varianza è rimosso dall’esperimento.
Sistema di monitoraggio del comportamento del mouse neonatale, utilizzata nel presente protocollo è il primo del suo genere. Intento di ricercatori per le ricerche etiche con topi neonati devono spesso affrontare l’impegnativa mancanza di risorse per valutare il benessere dell’animale a questa età. Il sistema di monitoraggio presentato intuitivo e coerenza comincia a colmare questa lacuna di conoscenza. D’importanza, questo approccio basato su prove non solo aumenta la qualità dei dati sperimentali ottenuti ma, allo stesso tempo, riduce anche la sofferenza degli animali da esperimento.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Speciale a Claire Harrison e l’Animal Care Facility presso British Columbia bambini Hospital Research Institute (BCCHR) per il loro supporto nel lavoro animale, così come al Dr. Po-Yan Cheng per loro guida e ingresso monitoraggio degli animali e sul benessere.
Materials
| 0.1 – 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 – 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 – 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 – 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
Referências
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