JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

В пробирке Assay для изучения агрегация белка Тау и наркотиков скрининг

Published: November 20, 2018
doi:
10.3791/58570
, ,
1Janssen Prevention Center,Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

Assay агрегации Тау, описанные в этой рукописи имитирует ожидаемых особенностей в vivo сворачиванию Тау и агрегации.

Abstract

Агрегация белка Тау и формирования винтовой паре нитей является отличительной особенностью болезни Альцгеймера и других tauopathies. По сравнению с другими белками, связанные с нейродегенеративных заболеваний, сообщил в vitro кинетика агрегации для белка Тау менее последовательным, представляя относительно высокой изменчивости. Здесь мы описываем развития в vitro агрегации assay который имитирует ожидаемый шаги, связанные с Тау сворачиванию и агрегации в естественных условиях. Assay использует длинный изоформы Тау (huTau441), который содержит N-терминальный кислой вставок, а также четыре микротрубочек связывания доменов (MBD). Агрегирование в vitro вызвана добавлением гепарина и непрерывно следуют Тиофлавин Т флуоресценции в формате 96 хорошо микроплиты. Assay агрегации Тау высоко воспроизводимых между различными скважин, экспериментальные запуски и пакетов белка. Агрегирование приводит к Тау PHF-как морфология, который является очень эффективным в посева образование de novo фибриллярного структур. В дополнение к его применение в изучении механизма Тау сворачиванию и агрегации текущий анализ является надежным инструментом для скрининга наркотиков, которые могут вмешиваться в патогенезе Тау.

Introduction

Болезнь Альцгеймера является разрушительным нейродегенеративных расстройств, которая определяется histopathologically накопление внеклеточного старческое бляшек агрегированных амилоид-beta1 и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков содержащие агрегированные hyperphosphorylated белка Тау2. Физиологические Тау мономерные и представлены как шесть уникальных изоформ, содержащий 0-2 терминала вставки N и 3 или 4 микротрубочек связывания доменов3,4 вытекающих из альтернативного сплайсинга и в среднем 2-3 phosphorylations. Считается, что hyperphosphorylation, сворачиванию и самостоятельной агрегации в фибриллово структуры являются ключевыми элементами в патогенезе Тау, как патологически начисленных в безумный человек5,6.

Агрегированные Тау нейрофибриллярных клубков являются визитной карточкой не только для объявлений, но и для других tauopathies, включая frontotemporal Лобар дегенерация (FTLD), болезнь пика, прогрессивный Надъядерный Паралич (PSP), лобно височной деменции (FTD) и первичной возрастные Таупатия (часть)2. С биохимической точки зрения, понимание механизма Тау сворачиванию и агрегирование может пролить свет на патологические процессы, связанные с AD и других tauopathies. В дополнение к научным аспектам надежные в vitro статистических анализов являются ценными инструментами для скрининга наркотиков кандидатов7,8,9,10. Считается, что агрегирование Тау следующим нуклеации зависимых полимеризации процесса (НДП)11,12,,1314. Кинетика НДП сигмоид и начинается с шага напористо неблагоприятно нуклеации, последовал процесс быстро, энергично низ агрегации.

В отличие от других amyloidogenic белков, включая прионных белков, бета-амилоида и α-synuclein Тау не спонтанно совокупности в физиологических условиях и даже экстремальные pHs или высоких температур не благоприятную для агрегирования15. Это наиболее вероятно объясняется гидрофильное взаимодействий в интерфейсе агрегации Тау. Однако Тау агрегаты эффективно при физиологических концентрациях при использовании индукторов например гепарина16 или17,другие полианионами18 .

Предыдущие усилия по созданию в vitro Тау статистических анализов пролил некоторый свет на детали Тау сворачиванию и агрегации, но они пришли короткий из имитирует то, что считается кинетики Тау агрегации в естественных условиях . В большинстве случаев кинетика агрегации Тау отсутствует этапа начальной задержки, связанные с Тау зародышеобразования. Это могло быть следствием использования концентрации белка очень высокий Тау, наличие агрегатов в начальной подготовке белка Тау и/или использование Тау фрагментов с гораздо более ярко выраженной склонности агрегации, чем более физиологических полная длина Тау белка19,20,21,22,23. Кроме того предыдущие исследования не рассматривался аспект надежности Тау агрегации кинетики и повторяемость.

Здесь мы описываем надежные в vitro Тау агрегации assay который имитирует основные характеристики нуклеации зависимых полимеризации с этапа первоначального ЛАГ соответствующий Тау нуклеации, следуют фазы экспоненциального роста. Кроме того сгенерированный рекомбинантных Тау агрегатов фибриллярного характер и имеют чрезвычайно высокой потенции посева. Assay высокую воспроизводимость также между сериями Тау и представляет собой ценный инструмент для ингибиторы агрегации.

Protocol

1. Реагент подготовка Реакция буфер Подготовить буфер реакции: 0,5 мм TCEP в PBS, рН 6,7 путем растворения сухого порошка TCEP (MW = 286.65 г/моль) в PBSstock растворе, рН 7,4.Примечание: Наличие TCEP-за преодоление агрегации исследования с использованием дикого типа Тау белком, который содержит которым. В текущем протоколе TCEP используется только для регулировки рН PBS от 7,4 до 6,7 и не играет никакой роли в регулировании любого окислительно-восстановительных реакций. Тщательно перемешать и фильтровать решение через мембранный фильтр PES размер поры стерильные 0,22 мкм. Алиготе и хранить на-80 градусов. Оттепель на скамейке и стабилизировать на RT перед использованием. huTau441 Удалить huTau441 (для см. выражение и очистки белков Apetri et al. 24) от-80 ° c морозильник. Оттепель на скамейке и сбалансировать до комнатной температуры (RT). Спиновые трубки с ложей белка для 5 мин при 12000 x g на 20-25 ° c для ликвидации пузырьков воздуха. Измерить концентрацию huTau441by поглощения в 280 Нм, используя коэффициент вымирания 0.31 мл мг-1см-1 Тиофлавин Т Подготовка 500 мкм Тиофлавин Т (ThT) раствор, растворяя 10 мг сухого порошка ThT (MW = 318.86 г/моль) в буфере реакции 35 мл. Перемешать, вихревой 3 раза в течение 20 секунд на максимальной скорости и через стерильную 0,22 мкм поры размера ПЭУ мембранный фильтр фильтр решение. Определить концентрацию путем поглощения измерений на 411 Нм, используя коэффициент вымирания 22000 M-1 см-1 и регулировка концентрации ThT до 500 мкм. Хранить при RT, защищенном от света месте. Подготовьте свежие каждые 2 месяца. Гепарин Готовить свежий раствор гепарина 55 мкм, растворяя 1 мг сухого порошка HMW гепарина (МВт = kDa 17-19) в 1 мл буфера реакции на RT. Встряхнуть и вихрь 2 раза за 5 секунд. Фильтр раствор через стерильную 0,20 мкм поры размера ПЭУ мембранный фильтр (шприц). 2. непрерывный режим ThT агрегации Assay на Считыватель микропланшетов мульти-режим Примечание: ThT краситель добавляется к реакции для мониторинга huTau441 агрегации кинетики в непрерывном режиме (автоматических измерений). Хотя реакция может сопровождаться регулярно флюорометр с использованием обычных кювета, ручной характер операции ограничивает частоту измерений и подрывает точность записанные кинетических кривых. По этой причине используется автоматическое Гонав мульти-режим чтения. Инструмент Настройка Включите компьютер и Считыватель микропланшетов мульти-режим. Пусть оборудование стабилизации за 10 минут. Запустите программное обеспечение и подготовить протокол. Выберите тип протокола: стандартный протокол (снижение данных осуществляется независимо для каждой пластины). Установите температуру на 37 градусов и выберите preheatment перед продолжением протокол. Установка кинетических запустить: запустить время 50 h / интервал измерения: 15 мин. Установите орбитальных встряхивания на 425 cpm (3 мм) в непрерывном режиме. Выберите метод чтения: флуоресценции интенсивности конечная точка/кинетическая – монохроматоры волн: возбуждения 440 Нм (20 Нм пропускная способность) / выбросов 485 Нм (20 Нм пропускная способность) – оптика должность: Топ – нормальная скорость – чтения читать высота: 4.50 мм Начало выполнения, созданный по протоколу. Имя эксперимент, выберите назначение вновь созданного файла и позволяют инструмент для заранее сбалансировать до желаемой температуры. Спонтанное huTau441 преобразования Подготовьте образец реакции в 1,5 мл. Использование 200 мкл смесь реакции и по крайней мере 4 реплицирует (том реакции для 4 реплицирует = 800 мкл). Подготовка 800 мкл реакции образца (в случае 4 реплицирует), содержащий 15 мкм huTau441, 8 мкм гепарин и 50 мкм ThT. Начните путем смешивания белка с буфером реакции, добавить гепарина и ThT и смешайте хорошо закупорить вверх и вниз 5 раз. Уважать указанный порядок добавления реагента. Спиновые образцы на 12000 x g и 25 градусов на 5 минут, чтобы устранить воздушные пузыри. Отказаться от 200 мкл пример реакции на скважину в 96-луночных планшетов (черный 96-луночных микропланшетов твердый, хорошо объем 360 мкл, Пологое дно). Избегайте образования пузырьков воздуха. Уплотнение микроплиты, чтобы избежать испарения. Гонав в Считыватель микропланшетов мульти-режим и начать измерения. После завершения эксперимента удалить пластину из оборудования и экспортировать данные в программное обеспечение для обработки данных. Проверка качества преобразования, сбор семян и хранения. Снять пластину sealer и объединить различные реплицирует в 1,5 мл пробирок. Хорошо перемешайте агрегированные образца в скважинах, закупорить вверх и вниз 2 раза прежде чем собирать его. Агрегаты, как правило, депозит на дне колодца. Смесь тщательно в 1,5 мл трубки, закупорить вверх и вниз 5 раз и отказаться от 10-20 мкл на поверхности слюды для анализа агрегатов на AFM (для дальнейших деталей смотрите Apetri et al. 24). Урожай агрегатов, крутя 1,5 мл на 20000 x g и 4 градусов за 1 час. Агрегатов форме гранул. Отдельные и анализировать супернатанта, S-МЭЛС для подтверждения отсутствия мономерных Тау в образце, указывающий успешное преобразование в агрегаты (для Подробнее см. Apetri и др. 24). Этикетке трубки 1,5 мл, содержащий остальные агрегаты (гранулы) указанием начального huTau441 концентрацию белка и объем образца. Оснастки заморозить агрегатов и хранить в-80 градусов. Реакция в сеяный Удалите huTau441 агрегатов из морозильной камеры-80 градусов. Добавьте объем буфера реакции указано на этикетке (объем исходного образца) и пусть трубки стабилизации RT. Ресуспензируйте агрегатов, закупорить вверх и вниз 5-8 раз. Sonicate статистические выборки. Для 200 мкл пример (15 мкм huTau441), sonicate на льду, с помощью microtip 1/8″(от 100 мкл до 10 мл) общей продолжительностью 15 s с помощью импульсов 1 s и пауз 2 s на 30% амплитуды (sonicator 250 Ватт). Заново сбалансировать образец RT.Примечание: Условия трудовой sonication привести к однородным населением Тау фибриллами с длиной 20-50 nm24. Подготовьте образец реакции в 1,5 мл пробирок. Использование 200 мкл смесь реакции и по крайней мере 4 реплицирует (том реакции для 4 реплицирует = 800 мкл). Подготовка 800 мкл пример реакции содержащий 15 мкм huTau441, 8 мкм гепарин и 50 мкм ThT. Начните путем смешивания белка с буфером реакции, добавить гепарина и ThT и смешайте хорошо закупорить вверх и вниз 5 раз. Уважать указанный порядок добавления реагента. Спиновые образцы на 12000 x g и 25 градусов на 5 минут, чтобы устранить воздушные пузыри. Отказаться от 200 мкл реакции образца за хорошо в 96-луночных (черный 96-луночных микропланшетов твердый, хорошо объем 360 мкл, Пологое дно). Избегайте образования пузырьков воздуха. Однородный тщательно преформированных фибриллярных образец повторяющихся вверх и вниз дозирование (5 раз) и добавить в каждый хорошо сумму, соответствующую желаемый процент семян. Для хорошо суммарный объем 200 мкл 2 мкл предварительно семян сложения является 1% (v/v). Микс, закупорить вверх и вниз 3 раза при добавлении к колодцу и избежать образования воздушных пузырей. Уплотнение микроплиты, чтобы избежать испарения. Гонав в Считыватель микропланшетов мульти-режим и начать измерения. Снять пластину от оборудования и экспортируйте данные в электронную таблицу.

Representative Results

Рекомбинантных huTau441 содержащий C291A и C322A мутации и N-терминальный его C-терминала C-Теги была выражена и очищенный ранее описанных24. Пакеты huTau441 очень чистый, как визуализировать на SDS-PAGE и практически 100% мономерных устанавливаемым S-МЭЛС (рис. 1). Агрегирование 15 мкм huTau441 было вызвано добавлением 8 мкм HMW гепарина и реакции непрерывно следуют ThT флуоресценции с использованием многомодового Гонав читателя. Длина волны возбуждения была 440 Нм (пропускная способность 20 Нм) тогда как выбросов была измерена на 485 (пропускная способность 20 Нм). Assay весьма воспроизводима, с результатами 10 отдельных скважин, будучи практически неотличимы (рис. 2A). После 50 h морфологии ThT положительные huTau441 агрегатов были оценены AFM. Агрегированных hutau441 представляет собой однородную смесь фибриллярного структур различных длин аналогичны сообщил ex vivo морфологии (Рисунок 2Б). Кроме того окончательный реакционную смесь не содержит мономера, предлагая полное преобразование в агрегатах, как показано на S-МЭЛС измерений (рис. 2 c). Кинетика huTau441 агрегации в независимой экспериментальной бежит очень похожи, как подчеркивается в аналогичного сигмоид кривых и неотличимы ЛАГ и роста фаз (рис. 3). Сохраняется высокий уровень воспроизводимости, когда используются различные пакеты белка (рис. 4). Кроме того предварительно huTau441 агрегатов являются очень эффективными в наборе Тау мономера и вызывая образование de novo Тау агрегатов. Как низко как 0,0025% (v/v) количество предварительно Тау агрегаты способны обойти нуклеации и триггер поколения de novo фибриллами (рис. 5). Рисунок 1: рекомбинантных huTau441 мономерные и очень чистая. A) чистоты оценки под денатурации условий на геля SDS-PAGE 4-12%, включая молекулярный вес стандартного белка лестница (в кДа) (Lane 1); поток через от последний шаг C-тег сродства очищения (Lane 2); Колонка мыть фракции (3 полосы), этого eluted пик белка huTau441, до (4 полосы) и после буфера обмена (5 Лейн), соответственно). B) S-МЭЛС анализ huTau441. Белок показывает > 99.9% мономерных молярной массой 51 кДа и не содержат агрегаты или фрагментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: агрегации рекомбинантных huTau441 высокую воспроизводимость и количественно приводит к фибриллярного структур. A) кинетики гепарина индуцированной агрегации huTau441 непрерывно в 96 хорошо Гонав формате контролируется ThT флуоресценции. Концентрации huTau441 и гепарин, 15 мкм и 8 мкм, соответственно. 10 индивидуальных кривых соответствуют преобразования той же партии белка в десяти скважин же микроплиты и характеризуются средняя (с SD) отставание фазы 14.2 ± 0,38 h и t50 18,8 ± 0,40 h. кинетических данных был оснащен 5-параметр логистикой c кривая с линейной снижением верхнего асимптотой. Запаздывание фазы и t50 были рассчитаны путем интерполяции между прогнозируемыми значениями линейной регрессии. Лаг-фазы рассчитывается на основе 3% увеличение ThT флуоресценции сигнала. Кривая уместно и сводные статистические данные полученные с помощью IBM SPSS статистический версии 20.0.0.2. B). Тау агрегатов Показать PHF-как морфологии как указано у Вообразимый AFM 50 ч; C). S-МЭЛС анализ мономерных huTau441 (t = 0 h) и супернатант реакционной смеси по завершении реакции (t = 50 h). В точке 50 h время реакционную смесь была центрифугируется на 1 ч на 20000 X g и 4 градусов и привела супернатанта, вводят на S-МЭЛС. Исчезновение мономера пик подтверждает полную совокупность Тау. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: assay агрегации Тау показывает высокую воспроизводимость между независимыми экспериментальные запуски. Две панели отображаются четыре отдельных кинетики следы для агрегирования спонтанное huTau441, собранных в два независимых экспериментов с использованием той же партии huTau441 белка. Концентрации huTau441 и гепарин, 15 мкм и 8 мкм, соответственно. Кинетика характеризуются средняя (с SD) отставание фазы 12.2 ± 0,18 h и t50 17.8 ± 0,8 h (запуск 1) и 11,6 ± 0,52 h и t50 ± 17.8 0.23 h (бег 2), соответственно. Кинетические данные был оснащен 5-параметр логистической кривой с линейной снижением верхнего асимптотой. T50 были рассчитаны путем интерполяции между прогнозируемыми значениями линейной регрессии. Лаг-фазы рассчитывается на основе 3% увеличение ThT флуоресценции сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: assay агрегации Тау показывает высокую воспроизводимость между разными сериями huTau441 белка. Каждая панель показывает, что четыре реплицирует соответствующий пакет конкретных huTau441. Агрегирование каждой партии последовало в независимых экспериментов. Концентрации huTau441 и гепарин, 15 мкм и 8 мкм, соответственно. Кинетика агрегирования соответствует четыре отдельных Тау, пакеты характеризуются средняя (с SD) отставание фазы 15.3 ± 0,38 h и t50 ± 21.1 0,46 h (серия 1); запаздывание фазы 12,5 ± 0,07 h и t50 19,8 ± 0.34 h (2 пакета); запаздывание фазы 15,1 ± 0.34 h и t50 ± 21,9 0.86 h (3 пакета) и отставание фазы 11,5 ± 0,29 h и t50 ± 17.8 0,29 h (4 партии), соответственно. Кинетические данные был оснащен 5-параметр логистической кривой с линейной снижением верхнего асимптотой. Запаздывание фазы и t50 были рассчитаны путем интерполяции между прогнозируемыми значениями линейной регрессии. Лаг-фазы рассчитывается на основе 3% увеличение ThT флуоресценции сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5: предварительно hutau441 агрегаты имеют высокие посевные активности. Чтобы начать посев, агрегаты sonicated Тау были добавлены на мономера hutau441. От красного к синему, каждый цвет различных кинетических кривых представляет различное количество добавлен семян: 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% и 0,0025% (v/v), соответственно. Спонтанное преобразования hutau441 представлена в черном. В составленном были протестированы все условия. Четыре кинетическая реплицирует, связанные с определенной концентрации семян высокую воспроизводимость и в большинстве случаев неразличимы. Концентрации hutau441 и гепарин, 15 мкм и 8 мкм, соответственно. Добавлением небольших количеств предварительно сформированных sonicated фибриллярного структур устраняет этапа начальной лаг, наблюдается в спонтанной конверсии и эффект пропорционален количество семян. От красного к синему разница в t50 наблюдается (t50 spont.conv-t50 посев) составляет 18,9, 18.40, 17,8, 17.3, 16.6, 16.1, 15,4, 14,7, 14.2 и 13,7 часов, соответственно. Спонтанное преобразования hutau441 характеризуется средний т50 (с SD) 19,85 ± 0,54 h. кинетических данных был оснащен 5-параметр логистической кривой с линейной снижением верхнего асимптотой. t50 были рассчитаны путем интерполяции между прогнозируемыми значениями линейной регрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Несмотря на многочисленные усилия кинетика агрегации Тау в литературе о Дата отсутствия желаемый уровень воспроизводимости и/или некоторые из особенностей нуклеации зависимых полимеризации19,20,21 , 22 , 23 , 25. это часто подчеркивается отсутствие участка запаздывания, неэффективных посева и не фибриллярный природы Тау агрегатов. Причины этих недостатков может меняться и включает в себя субоптимальных Тау качества протеина (фрагментация, наличие агрегатов, низкой чистоты, и т.д.), выбор белка и вызывая реагентов, и или экспериментальных условиях. Еще одним осложняющим фактором являются два хвоща остатки расположенных вокруг Тау агрегации интерфейса, которые можно сформировать внутри – или Интер – молекулярных дисульфидных мостов в зависимости от окружающей среды окислительно-восстановительные и влияют на эффективность Тау агрегации. В большинстве подходов снижения реагенты, такие как DTT или TCEP были использованы для поддержания остатков цистеина в восстановленных форм и таким образом увеличить уровень воспроизводимости25. Кроме того Коэффициент вымирания Тау является очень низким, что приводит к трудностям в точных измерений концентрации белка.

Мы особенно посвящены несколько параметров и атрибуты качества, которые мы рассматривали решающее значение для надежной, воспроизводимые и представитель агрегации профиль белка Тау: исключающий возможность интра – и Интер-молекулярных дисульфида формирования, создание высоко чистый Тау мономера и повышение точности определения концентрации. Все эти реагент связанные вопросы потенциальных точек внимания, которые мы рассматривали решающее значение для оптимальной пробирного развития. Для решения этих вопросов, была выражена полная длина huTau441 с двумя мутации, C291A и C322A и с N – и C-терминала Теги. Мутация остатков цистеина оказывает минимальное влияние на белка Тау устраняя иначе очень трудно контролировать преодоление дисульфида. Выражая белка с относительно коротким N – и C-терминала Теги позволило нам продолжать двухэтапный сродства очищения протокол, который привело к очень высокой чистоты, целостности и мономера контента. Кроме того мы ввели F8W мутации, что увеличился коэффициент вымирания белка и позволили гораздо более точные измерения концентрации24.

Помимо использования высококачественного белка реагентов, другие параметры анализа были также оптимизирован. Оптимальное Тау: гепарин соотношение было определено около 0.5 (М/М), который соответствует ранее опубликованных исследований26. Кроме того механических и оптических инструментальные параметры имеют решающее значение для обеспечения воспроизводимости и оптимальные параметры могут отличаться в некоторой степени в зависимости от производителя.

Агрегирование Тау, описанные в этом assay показывает характеристики, которые связаны с Тау патогенеза в AD и связанных с tauopathies. Этот процесс начинается с этапа первоначального ЛАГ соответствующий формирования высокой энергии ядра и сопровождается фазы быстрого роста, что соответствует росту волосики. Время запаздывания достаточно долго, чтобы открыть окно широкую подробно изучить посевной процесс, охватывающий широкий спектр семян концентрации (.рис. 5) пока еще не слишком долго, чтобы избежать деградации белков и/или неспецифических агрегации (Рисунок 2). Эти вторичные события особенно может произойти когда неразрывно неупорядоченных белков, таких как huTau441 подвергается в течение длительных периодов времени в физиологических условиях. Полученные Тау агрегатов отображения морфология PHFs изолированы от мозг больных ад и являются очень эффективными в плане найма мономерных Тау и преобразования его в de novo генерируется агрегатов, процесс, именуемый посева. Assay высокую воспроизводимость, кинетические кривые, будучи практически неотличимы между скважин, экспериментальные запуски и белка пакетов. Хотя текущий assay фокусируется только на длинный изоформы Тау, huTau441, приложение может быть адаптирована для изучения преобразования других форм Тау (Ameijde et al., Acta Neuropathologica коммуникаций, в печати) Кроме того, он позволяет механистический исследования сосредоточены на взаимодействии изоформ Тау и возможно пролить свет на различия между патогенеза Тау в ад, где 3R и 4R изоформ присутствуют в PHFs и пика болезни или слабоумия Frontotemporal где Тау патологии содержит главным образом 3R и 4R Тау изоформ, соответственно27.

Очень высокая воспроизводимость assay должны позволить читателям его реализации с относительной легкостью в их конкретных лабораторных параметров. Assay имитирует то, что считается в vivo сворачиванию и агрегирования Тау, включение механистический исследования, которые прольют свет на патогенез Тау и он является ценным инструментом для скрининга наркотиков кандидатов и оценивать их вмешательства с различные этапы процесса патогенеза.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Гектор Quirante для очистки huTau441 и выражение, Hanna Inganäs и Ван Винзен Margot за отличную техническую поддержку и Мартин Koldijk для анализа данных.

Materials

Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer’s disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer’s disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Bioquímica. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Bioquímica. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer’s disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Bioquímica. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Bioquímica. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer’s disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Bioquímica. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer’s disease and the tauopathies. Bioquímica. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick’s disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Tags

Tau ProteinAlzheimer’s DiseaseTauopathiesAggregation AssayDrug ScreeningNucleation-dependent PolymerizationRecombinant TauFluorescenceSEC-MALSHeparinThioflavin-TMicroplate Reader

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image