JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

Published: November 20, 2018
doi:
10.3791/58570
, ,
1Janssen Prevention Center,Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

וזמינותו צבירת טאו תיאר כתב יד זה מחקה את התכונות הצפויה של ויוו misfolding טאו צבירה.

Abstract

צבירה של חלבון טאו ועל היווצרות חוטים לוליינית לזווג מהווה סימן היכר של מחלת אלצהיימר ומחלת tauopathies אחרים. לעומת לחלבונים אחרים הקשורים עם מחלות ניווניות, קינטיקה צבירת שדווחה במבחנה על חלבון טאו הם פחות עקבי הצגת השתנות גבוהה יחסית. כאן נתאר את התפתחות במבחנה צבירת assay המחקה את השלבים הצפויים המשויך טאו misfolding, צבירת vivo בתוך… וזמינותו משתמש את הארוך טאו isoform (huTau441) אשר מכיל גם מוסיף חומצי N-מסוף, כמו גם ארבעה microtubule מחייב תחומים (מבד). במבחנה הצבירה המופעלות על-ידי תוספת של הפארין, ואחריו ברציפות thioflavin T פלורסצנטיות בתבנית 96 microplate טוב. וזמינותו צבירת טאו הוא מאוד לשחזור בין וולס שונים, פועל ניסיוני אצוות של החלבון. הצבירה מוביל טאו מורפולוגיה PHF דמוי אשר יעילה מאוד בזריעה היווצרות מבנים fibrillar de novo . בנוסף, היישום שלה ללמוד את המנגנון של טאו misfolding, צבירת וזמינותו הנוכחי הוא כלי חזקים לסינון סמים שעלולה להפריע בפתוגנזה של טאו.

Introduction

מחלת האלצהיימר היא הפרעה ניווניות הרסנית histopathologically המוגדרת על ידי ההצטברות של הפלאק סנילי חוץ-תאי של צבור עמילואיד ביתא1 ומצטברים תאיים קשרים neurofibrillary המכיל חלבון טאו hyperphosphorylated2. טאו פיזיולוגיות הוא monomeric והוצגה בתור שישה איזופורמים ייחודי המכיל 0-2 N טרמינל טרנזקציות insert ואיגוד microtubule 3 או 4 תחומים3,4 הנובעים שחבור חליפי ו ממוצע של 2-3 phosphorylations. הוא האמין כי hyperphosphorylation, misfolding, צבירת עצמית למבנים fibrillary מהווים את מרכיבי המפתח בהפתוגנזה טאו, כמו הערכה פתולוגית יחידים מטורפת5,6.

הישבן טאו neurofibrillary צבור הם סימני ההיכר לא רק עבור המודעה, אלא גם עבור אחרים tauopathies, כולל ניוון frontotemporal אוני (FTLD), פיק המחלה, שיתוק גרעיני מתקדם וניוון בסים פרוגרסיבי (PSP), דמנציה fronto-טמפורלית (חדרתי) יסודי tauopathy הקשורות לגיל (חלק)2. מנקודת מבט הביוכימי, הבנת המנגנון של טאו misfolding, צבירת יכול לשפוך אור על התהליכים הפתולוגיים המשויך AD ו tauopathies אחרים. בנוסף ההיבט המדעי, חזקים במבחנה צבירת מבחני הם כלי רב ערך עבור הקרנה של סמים מועמדים7,8,9,10. הוא האמין כי הצבירה של טאו עוקב אחר התגרענות הפילמור תלוי תהליך (NDP)11,12,13,14. קינטיקה נתפרש זה sigmoidal ומתחיל שלב התגרענות אנרגטית שלילי ואחריו תהליך צבירת בירידה מהר אנרגטית.

בניגוד לחלבונים amyloidogenic אחרים, כולל חלבון פריאון, בטא עמילואיד, α-synuclein, טאו ולא באופן ספונטני צבורים בתנאים פיזיולוגיים, pHs אפילו קיצוני או טמפרטורות גבוהות שאינה-מסיע צבירת15. זה נובע ככל הנראה האינטראקציות hydrophylic נוכח בממשק מצבור של טאו. עם זאת, טאו אגרגטים ביעילות בריכוזים פיזיולוגיים כאשר inducers כגון הפרין16 או17,אחרים polyanions18 נמצאים בשימוש.

הניסיונות להגדרת במבחנה טאו צבירת מבחני יש לשפוך קצת אור על הפרטים של טאו misfolding, צבירה, אבל הם באו קצר מחקה מה הוא האמין להיות ויוו טאו צבירת קינטיקה. ברוב המקרים, קינטיקה מצבור טאו היה חסר השלב הראשוני לג המשויך התגרענות טאו. זה היה התוצאה של שימוש ריכוז חלבון טאו גבוהה מאוד, נוכחות של אגרגטים בזמן ההכנות חלבון טאו ההתחלה ו/או שימוש של טאו קטעים עם נטיה צבירת גבוה הרבה יותר טאו באורך מלא יותר פיזיולוגית חלבון19,20,21,22,23. יתר על כן, מחקרים קודמים לא התייחסו את הפארמצבטית ואת החוסן היבט קינטיקה צבירת טאו.

כאן, אנו מתארים חזקים במבחנה טאו צבירת assay אשר מחקה את המאפיינים העיקריים של פלמור התלויים התגרענות עם שלב ראשוני לג התואם התגרענות טאו ואחריו שלב הגידול המעריכי. יתר על כן, מצרפי טאו רקומביננטי שנוצר fibrillar בטבע, יש של עוצמת זריעה גבוהה מאוד. וזמינותו הוא מאוד לשחזור גם בין טאו אצוות ומייצג כלי רב ערך על המסך עבור מעכבי צבירה.

Protocol

1. מגיב הכנה התגובה מאגר הכנת מאגר התגובה: 0.5 מ מ TCEP ב- PBS, pH 6.7 על ידי המסת אבקה יבשה TCEP (MW = g 286.65/mol) בתמיסה PBSstock, pH 7.4.הערה: הנוכחות של TCEP נובעת גישור צבירת מחקרים באמצעות חלבון טאו פראי סוג המכיל cysteines. בפרוטוקול הנוכחי, TCEP משמש רק כדי להתאים את ה-pH של PBS מ- 7.4 עד 6.7 ומשחק אין תפקיד בוויסות כל תגובות חמצון-חיזור. לערבב ביסודיות, לסנן את הפתרון דרך מסנן ממברנה μm 0.22 סטרילי PES גודל הנקבוביות. Aliquot, חנות ב-80 הלעפה תרוטרפמט. להפשיר על הספסל ולייצב ב RT לפני השימוש. huTau441 להסיר huTau441 (עבור ראה ביטוי וטיהור חלבונים Apetri. et al. 24) מ-80 הלעפה תרוטרפמט מקפיא. להפשיר על הספסל, equilibrate לטמפרטורת החדר (RT). ספין צינור עם חלבון המניה במשך 5 דקות ב 12,000 g x ב- 20-25 הלעפה תרוטרפמט לחסל בועות אוויר. למדוד את ריכוז huTau441by הקליטה ב- 280 ננומטר באמצעות מקדם של הכחדה של 0.31 mL מ ג-1ס מ-1 Thioflavin T הכנת 500 μM thioflavin T (ThT) פתרון מניות על ידי המסת 10 מ ג של אבקה יבשה ThT (MW = 318.86 g/mol) במאגר תגובה 35 מ ל. לערבב ביסודיות, מערבולת 3 פעמים במשך 20 שניות במהירות המרבית, לסנן את הפתרון דרך סטרילי 0.22 μm נקבובית גודל פסי ממברנה מסנן. לקבוע ריכוז על ידי מדידות הקליטה-411 nm באמצעות מקדם של הכחדה של 22,000 מ-1 ס מ-1 ולהתאים ריכוז ThT 500 μM. חנות-RT מוגן מפני אור. להכין טרי כל חודשיים. הפארין להכין טרי 55 μM הפארין פתרון על ידי המסת 1 מ ג של HMW הפארין אבקה יבשה (MW = 17-19 kDa) במאגר תגובה 1 מ”ל ב- RT. לנער נמרצות ושעות מערבולת 2 למשך 5 שניות. ינוע פתרון סטרילי 0.20 μm נקבובית גודל פסי ממברנה מסנן (מזרק). 2. רציף ThT צבירת Assay על קורא Microplate רב במצב הערה: ThT צבע נוסף התגובה לעקוב אחר huTau441 קינטיקה צבירת במצב מתמשך (מידות אוטומטי). למרות התגובה יכולה להיות מלווה fluorometer רגיל שימוש של cuvette המקובלת, אופי הפעולה הידנית מגביל את התדירות של מדידות, פוגעת את הדיוק של עקומות קינטי מוקלט. מסיבה זו, נעשה שימוש בקורא microplate רב במצב אוטומטי. מכשיר להגדיר הפעל את המחשב ואת הקורא רב במצב microplate. תן את הציוד לייצב במשך 10 דקות. להפעיל את התוכנה ולהכין פרוטוקול. בחר את סוג הפרוטוקול: פרוטוקול סטנדרטי (הפחתת נתונים מתבצעת באופן עצמאי עבור כל צלחת). השוכן הטמפרטורה הלעפה תרוטרפמט 37 ובחר preheatment לפני שתמשיך את הפרוטוקול. הגדר הפעלה קינטי: בזמן זובידאת ריצה / מרווח זמן מדידה: 15 דקות. הגדר מסלולית רועדת-425 cpm (3 מ”מ) במצב מתמשך. בחר את שיטת קריאה: קרינה פלואורסצנטית בעוצמה קצה/קינטית – Monochromators אורכי גל: עירור 440 ננומטר (20 ננומטר רוחב פס) / פליטה 485 nm (20 ננומטר רוחב פס) – אופטיקה הצב: העליון – רגיל לקרוא מהירות – לקרוא את גובה: 4.50 מ מ התחל הפעלה באמצעות פרוטוקול שנוצר. שם הניסוי, בחר את היעד של הקובץ שנוצר ולאפשר את המכשיר equilibrate מראש לטמפרטורה הרצויה. המרה huTau441 ספונטנית הכנת המדגם התגובה צינור 1.5 מ. שימוש 200 מיקס μL לכל תגובה ומשוכפלת לפחות 4 (התגובה נפח עבור 4 משכפל = 800 μL). להכין 800 μL התגובה מדגם (במקרה של משכפל 4) המכיל 15 μM huTau441, הפארין μM 8 ו- 50 μM ThT. התחל על ידי ערבוב החלבון עם המאגר התגובה, מוסיפים הפארין ו ThT ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. לכבד את הסדר שצוין עבור הוספת ריאגנט. ספין דגימות-12,000 x g ו- 25 הלעפה תרוטרפמט עבור 5 דקות כדי לחסל בועות אוויר. לוותר על μL 200 התגובה מדגם לכל טוב ב 96-ובכן microplates (microplate מוצק שחור 96-ובכן, ובכן בנפח 360 μL, בתחתית שטוח). למנוע היווצרות בועות אוויר. חותם microplate כדי למנוע התאיידות. מקום microplate בקורא רב במצב microplate ולהתחיל מדידות. לאחר סיום הניסוי, הסר לוחית של ציוד, ייצוא נתונים לתוכנת עיבוד נתונים. בדיקת האיכות של ההמרה, הזרעים אחסון. הסרת חותם הצלחת, בריכה משכפל שונים צינורות 1.5 mL. מערבבים היטב המדגם צבורים ב הבארות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 2 פעמים לפני איסוף זה. אגרגטים נוטים להפקיד בתחתית הבאר. לערבב היטב בתוך 1.5 mL טורפדו על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים, לוותר על 10-20 μL על משטח נציץ ניתוח מצרפי על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (עבור פרטים נוספים ראו Apetri. et al. 24). הקציר מצרפי על ידי סחרור הצינור 1.5 mL ב20, 000-g ו- 4 הלעפה תרוטרפמט למשך שעה. אגרגטים בצורת גלולה. להפריד ולנתח תגובת שיקוע על ידי S-MALS כדי לוודא העדר של טאו monomeric במדגם המציין המרה מוצלחת לתוך אגרגטים (עבור ראה פרטים בהמשך. Apetri et al. 24). תווית הצינור 1.5 mL המכיל מצרפי הנותרים (גלולה) המציין huTau441 הראשונית חלבון ריכוז ונפח הדגימה. הצמד להקפיא מצרפי ולאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט. התגובה הזריעה הסר אגרגטים huTau441-80 הלעפה תרוטרפמט מקפיא. הוסף עוצמת התגובה מאגר המצוין על התווית (נפח דגימה ראשונית) ולתת את הצינור לייצב את RT. Resuspend מצרפי על-ידי pipetting למעלה ולמטה 5 עד 8 פעמים. Sonicate המדגם צבורים. עבור מדגם 200 μL (15 μM huTau441), sonicate על הקרח באמצעות microtip “1/8 (מ 100 μL עד 10 מ”ל) לתקופה כוללת של 15 s באמצעות פולסים של 1 s ואת ההפסקות של 2 s ב- 30% משרעת (sonicator 250 וואט). הדגימה מחדש equilibrate כדי RT.הערה: התנאים sonication מועסקים להוביל אוכלוסיה הומוגנית של טאו הסיבים באורכים של 20-50 ננומטר24. הכנת המדגם התגובה 1.5 mL צינורות. שימוש 200 מיקס μL לכל תגובה ומשוכפלת לפחות 4 (התגובה נפח עבור 4 משכפל = 800 μL). להכין 800 מדגם התגובה של μL, המכיל 15 μM huTau441, 8 μM הפרין ו- 50 μM ThT. התחל על ידי ערבוב החלבון עם המאגר התגובה, מוסיפים הפארין ו ThT ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. לכבד את הסדר שצוין עבור הוספת ריאגנט. ספין דגימות-12,000 x g ו- 25 הלעפה תרוטרפמט עבור 5 דקות כדי לחסל בועות אוויר. לוותר על μL 200 התגובה מדגם לכל טוב 96-היטב (microplate מוצק שחור 96-ובכן, ובכן בנפח 360 μL, בתחתית שטוח). למנוע היווצרות בועות אוויר. Homogenize ביסודיות את הדגימה preformed fibril מאת חוזרות למעלה ולמטה pipetting (5 פעמים) ולהוסיף כל טוב את הכמות המתאימה האחוז הרצוי של זרעים. עבור אמצעי אחסון 200 μL טוב מוחלט, μL 2 של זרע preformed בנוסף הוא 1% (v/v). מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה 3 פעמים בעת הוספת הבאר ולמנוע היווצרות בועות אוויר. חותם microplate כדי למנוע התאיידות. מקום microplate בקורא רב במצב microplate ולהתחיל מדידות. הסר לוחית של ציוד ולייצא נתונים לגיליון אלקטרוני.

Representative Results

HuTau441 רקומביננטי המכיל את מוטציות C291A, C322A ו- N-מסוף שלו ושל C-מסוף C-תגיות היה בא לידי ביטוי וטיהרו כאמור תיאר24. קבוצות huTau441 הם מאוד טהור כמו מטמיעים מרחביות-דף, כמעט 100% monomeric כפי מוערך על ידי S-MALS (איור 1). הצבירה של 15 מיקרומטר huTau441 היה המושרה על ידי התוספת של 8 מיקרומטר HMW הפארין, התגובה ואחריה ברציפות פלורסצנטיות ThT שימוש בקורא כינוייהם microplate. אורך הגל עירור היה 440 ננומטר (רוחב פס 20 ננומטר) ואילו פליטה נמדדה ב 485 nm (רוחב פס 20 ננומטר). וזמינותו היא מאוד לשחזור, עם תוצאות מבארות בודדים 10 להיות זהה כמעט לחלוטין (איור 2 א). מורפולוגיות של מצרפי huTau441 חיובי ThT היו לאומדן לאחר זובידאת AFM. Hutau441 צבור הוא תערובת הומוגנית של מבנים fibrillar באורכים שונים דומה שדווח שמחוץ מורפולוגיות (איור 2B). יתר על כן, תערובת התגובה הסופי אינו מכיל מונומר, רומז המרה מלאה לתוך אגרגטים כפי שמוצג על ידי מידות S-MALS (איור 2C). קינטיקה של מצבור huTau441 ברצף ניסיוני עצמאי דומים מאוד כמו הדגיש עקומות sigmoidal דומה, שלבים לג וצמיחה להבחין מגניחותיה (איור 3). רמה גבוהה של הפארמצבטית נשמרת כאשר קבוצות שונות של חלבונים משמשים (איור 4). יתר על כן, preformed huTau441 אגרגטים יעילים מאוד בגיוס טאו מונומר, וגורם להיווצרות אגרגטים טאו דה נובו . כמויות המתחילים 0.0025% (v/v) של טאו preformed אגרגטים מסוגלים לעקוף התגרענות ההדק דור של הסיבים דה נובו (איור 5). איור 1: Recombinant huTau441 הוא monomeric וטהור מאוד. א) הערכת טוהר תחת תנאים על ג’ל מרחביות-דף 4-12% כולל משקל מולקולרי הסולם חלבון סטנדרטית (ב- kDA) denaturing (ליין 1); זורמת דרך מ C-תג קירבה טיהור השלב הסופי (ליין 2); שבר שטיפת העמודה (ליין 3), eluted שיא חלבון huTau441, לפני (ליין 4) ולהחליף לאחר מאגר (ליין 5), בהתאמה). ב) ניתוח S-MALS huTau441. חלבון מראה > 99.9% monomeric עם מסה טוחנת של 51 kDa, אינו מכיל אגרגטים או חלקים ממנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: צבירה של recombinant huTau441 הוא מאוד לשחזור, מוביל באופן כמותי מבנים fibrillar. א) קינטיקה של הפארין המושרה huTau441 צבירת מנוטרים באופן רציף בתבנית microplate טוב 96 על-ידי קרינה פלואורסצנטית ThT. ריכוזי huTau441 הפארין הם 15 מיקרומטר ו 8 מיקרומטר, בהתאמה. העקומות בודדים 10 שיתאימו ההמרה מאותה אצווה חלבון בבארות עשר של microplate אותו, מאופיינים שלב השהיה הממוצע (עם SD) של 14.2 ± 0.38 h ו- t50 של 18.8 ± ה 0.40 נתונים קינטי הורכב logisti 5-פרמטר עקומת c עם ירידה אסימפטוטה העליון ליניארי. לג שלב ו- t50 חושבו על ידי אינטרפולציה בין הערכים החזויים מאת רגרסיה ליניארית. שלב ההשהיה מחושב בהתבסס על 3% גידול של ThT פלורסצנטיות אות. עקומת הסטטיסטיים סיכום הולם מתקבלים באמצעות IBM SPSS גירסה סטטיסטיקה 20.0.0.2. B). טאו אגרגטים להראות כמו PHF מורפולוגיות כמצוין על-ידי הדמיה AFM-זובידאת; ג). ניתוח S-MALS של monomeric huTau441 (t = 0 h), את תגובת שיקוע של תערובת התגובה בסיום התגובה (t = 50 h). בנקודת הזמן זובידאת תערובת התגובה היה centrifuged עבור h 1 ב 20,000 X g ו 4 הלעפה תרוטרפמט את תגובת שיקוע הביא מוזרק על S-MALS. היעלמותו של הפסגה מונומר מאשר צבירה מלאה של טאו… אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: טאו צבירת וזמינותו מראה הפארמצבטית גבוהה בין פועל ניסיוני עצמאי. הלוחות שני מציגים ארבעה עקבות קינטיקה הפרט לצורך צבירת huTau441 ספונטנית שליקט שני ניסויים עצמאית באמצעות מאותה אצווה של חלבון huTau441. ריכוזי huTau441 הפארין הם 15 מיקרומטר ו 8 מיקרומטר, בהתאמה. קינטיקה מאופיינים שלב השהיה הממוצע (עם SD) של 12.2 ± 0.18 h, t50 של 17.8 ± 0.8 h (להפעיל 1) ו- 11.6 ± 0.52 קג h ו- t50 של 17.8 ± 0.23 h (לרוץ 2), בהתאמה. נתונים קינטי הורכב עקומה לוגיסטית 5-פרמטר עם ירידה אסימפטוטה העליון ליניארי. T50 חושבו על ידי אינטרפולציה בין הערכים החזויים מאת רגרסיה ליניארית. שלב ההשהיה מחושב בהתבסס על 3% גידול של ThT פלורסצנטיות אות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: טאו צבירת וזמינותו מראה הפארמצבטית גבוהה בין קבוצות שונות של חלבון huTau441. כל לוח מציג שארבעה משכפל המתאים אצווה huTau441 ספציפיים. הצבירה של כל אצווה עקבו בניסויים עצמאית. ריכוזי huTau441 הפארין הם 15 מיקרומטר ו 8 מיקרומטר, בהתאמה. קינטיקה צבירת התואם טאו בודדים ארבע אצוות מאופיינים שלב השהיה הממוצע (עם SD) של 15.3 ± 0.38 h ו- t50 של 21.1 ± 0.46 h (אצווה 1); שלב ההשהיה של 12.5 ± 0.07 h, t50 של 19.8 ± h 0.34 (אצווה 2); לג שלב של ± נמצא 15.1 0.34 h ו- t50 של 21.9 ± 0.86 h (אצווה 3), לג שלב של 11.5 ± 0.29 h ו- t50 של 17.8 ± 0.29 h (אצווה 4), בהתאמה. נתונים קינטי הורכב עקומה לוגיסטית 5-פרמטר עם ירידה אסימפטוטה העליון ליניארי. לג שלב ו- t50 חושבו על ידי אינטרפולציה בין הערכים החזויים מאת רגרסיה ליניארית. שלב ההשהיה מחושב בהתבסס על 3% גידול של ThT פלורסצנטיות אות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5: Preformed hutau441 אגרגטים יש גבוה זריעה פעילות. ליזום זריעה, טאו sonicated אגרגטים נוספו מונומר hutau441. מאדום לכחול, כל צבע של עקומות קינטית שונה מייצגת את כמות נוספת זרעים שונים: 1.25%, 0.63%, 0.31%, 0.16%, 0.08%, 0.04%, 0.02%, 0.01%, 0.005% ו- % 0.0025 (v/v), בהתאמה. המרה ספונטנית של hutau441 מיוצג בשחור. כל התנאים נבדקו ארבע פעמים. ארבע קינטי משכפל המשויך ריכוז מסויים של הזרעים הם מאוד הדירים להבחין מגניחותיה ברוב המקרים. ריכוזי hutau441 הפארין הם 15 מיקרומטר ו 8 מיקרומטר, בהתאמה. התוספת של כמויות קטנות של מבנים fibrillar sonicated הקבועים מראש מבטל השלב הראשוני לג שנצפתה ההמרה ספונטנית, האפקט הוא יחסי עם כמות זרעים. מאדום לכחול, ההבדל ב- t50 שנצפו (t50 spont.conv-t50 זריעה) הוא 18.9, 18.40, 17.8, 17.3, 16.6, 16.1, 15.4, 14.7, 14.2 13.7 שעות, בהתאמה. המרה ספונטנית של hutau441 מאופיין של ממוצע t50 (עם SD) של 19.85 ± ה 0.54 נתונים קינטי הורכב עקומה לוגיסטית 5-פרמטר עם ירידה אסימפטוטה העליון ליניארי. t50 חושבו על ידי אינטרפולציה בין הערכים החזויים מאת רגרסיה ליניארית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

למרות המאמצים הרבים, קינטיקה מצבור טאו דיווחו בספרות כדי חוסר תאריך את הרמה הרצויה של הפארמצבטית ו/או כמה מן התכונות של20,21 19,פלמור התלויים התגרענות , 22 , 23 , 25. זה לעיתים קרובות מודגשת על ידי חוסר של שלב ההשהיה, זריעה לא יעיל והטבע הלא-fibrillar של אגרגטים טאו. הסיבה חסרונות אלה עשויים להשתנות, כולל איכות חלבון טאו תת אופטימלית (פיצול, נוכחות של אגרגטים, טוהר נמוך, וכו ‘.), בחירה של חלבון וגרימת ריאגנטים ו/או תנאי הניסוי. גורם נוסף לסבך שני ציסטאין שאריות הממוקמים ברחבי הממשק צבירת טאו שניתן ליצור אינטרה – או אינטר – דיסולפידי מולקולרית גשרים בהתאם חמצון-חיזור הסביבה משפיעות על היעילות של צבירת טאו. ברוב הגישות הפחתת ריאגנטים כגון DTT או TCEP שימשו כדי לשמר את שאריות ציסטאין בצורות מופחתת, ובכך להגדיל את רמות של הפארמצבטית25. יתר על כן, המקדם הכחדה של טאו הוא נמוך מאוד מה שמוביל לקשיי מדידות מדויקות של ריכוז חלבון.

התמקדנו בעיקר על כמה פרמטרים ותכונות איכות אנחנו נחשבים חיונית עבור פרופיל צבירת חזקים, נציג הדירים חלבון טאו: ביטול האפשרות של “אינטרה” – של אינטר-היווצרות דיסולפידי מולקולרית, הפקת מונומר של טאו טהור מאוד ולשפר את מידת הדיוק של ריכוז נחישות. כל ריאגנט אלה הקשורים השאלות הן הפוטנציאל נקודות תשומת לב אנחנו נחשבים קריטית לפיתוח אופטימלי וזמינותו. כדי לטפל בבעיות אלה, באורך מלא huTau441 בא לידי ביטוי עם שתי מוטציות, C291A, C322A, ועם N – ו C-מסוף תגיות. מוטציה של משקעי ציסטאין יש השפעה מינימלית על חלבון טאו תוך צמצום אחרת קשה מאוד לשלוט גשר דיסולפידי. לבטא את החלבון עם תגי קצר יחסית N – ו C-מסוף מותר לנו לרדוף פרוטוקול טיהור זיקה בשני שלבים אשר הובילה טוהר גבוהה מאוד, שלמות, מונומר תוכן. יתר על כן, הצגנו מוטציה F8W אשר גדל המקדם הכחדה של החלבון ואסור ריכוז הרבה יותר מדויק מדידות24.

בנוסף לשימוש ריאגנטים חלבון באיכות גבוהה, אופטימציה גם פרמטרים אחרים וזמינותו. טאו האופטימלית: יחס הפארין זוהתה להיות סביב 0.5 (חודשי) אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו בעבר26. יתר על כן, מכני והגדרות פלייבק אופטי מכריעים להבטיח הפארמצבטית, פרמטרים אופטימליים עשויים להיות שונים במידה מסוימת בהתאם ליצרן.

הצבירה של טאו שמתואר assay הזה מציג מאפיינים משויכים טאו פתוגנזה לספירה, הקשורות tauopathies. התהליך מתחיל עם שלב ההשהיה הראשוני המתאים היווצרות של הגרעינים אנרגיה גבוהה, ואחריו שלב הצמיחה המהירה שמתאים לצמיחה fibril. זמן ההשהיה היא ארוכה דיה כדי לפתוח חלון רחב כדי ללמוד בפירוט את התהליך זריעה המכסים מגוון רחב של ריכוז הזרע (איור 5) בעוד עדיין לא יותר מדי זמן אז השפלה חלבון ו/או צבירת שאינם ספציפיים הם נמנעו (איור 2)-אירועים משני אלה יכול לקרות במיוחד כאשר חלבון המתוסבכים מהותי כגון huTau441 נחשף במשך פרקי זמן ארוכים בתנאים פיזיולוגיים. התצוגה אגרגטים טאו שהושג המורפולוגיה של PHFs מבודד מוחות של חולי אלצהיימר, יעילים מאוד בגיוס טאו monomeric ואת המרתה דה נובו שנוצר אגרגטים, תהליך המכונה זריעה. וזמינותו היא מאוד לשחזור, עקומות קינטי להיות הטיוטות בין בארות, פועל ניסיוני אצוות חלבון. למרות וזמינותו הנוכחית מתמקדת רק isoform טאו הארוך, huTau441, היישום יכול להיות מותאם כדי ללמוד את ההמרה של צורות אחרות של טאו (Ameijde. et al., Acta Neuropathologica בתקשורת, בעיתונות) יתר על כן, היא מאפשרת מחקרים מכניסטית התמקדו המרצד איזופורמים טאו, אולי לשפוך אור על ההבדלים בין טאו פתוגנזה לספירה איפה איזופורמים 3R וגם 4R נמצאים ב- PHFs ופיק מחלה או סיבה יחידה ומובהקת איפה טאו פתולוגיה מכיל בעיקר 3R ו- 4R טאו איזופורמים, בהתאמה27.

הפארמצבטית גבוהה מאוד של וזמינותו צריך לאפשר לקוראים ליישם אותו בקלות יחסית בהגדרות מעבדה הספציפי שלהם. וזמינותו מחקה מה הוא האמין להיות ויוו misfolding, צבירה של טאו, הפעלת מחקרים מכניסטית תוכל לשפוך אור על טאו פתוגנזה וזה מהווה כלי חשוב לסינון מועמדים סמים ולהעריך הפרעות שלהם עם השלבים השונים של תהליך פתוגנזה.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות הקטור Quirante כדי להפוך את הביטוי טיהור של huTau441, חנה Inganäs, מרגוט Winsen ואן לתמיכה טכנית מצוינת, מרטין Koldijk לניתוח נתונים.

Materials

Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer’s disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer’s disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Bioquímica. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Bioquímica. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer’s disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Bioquímica. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Bioquímica. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer’s disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Bioquímica. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer’s disease and the tauopathies. Bioquímica. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick’s disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Tags

Tau ProteinAlzheimer’s DiseaseTauopathiesAggregation AssayDrug ScreeningNucleation-dependent PolymerizationRecombinant TauFluorescenceSEC-MALSHeparinThioflavin-TMicroplate Reader

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image