Estructura cristalina del dominio N-terminal del Receptor de rianodina de Plutella xylostella

Receptores de rianodina (RyRs) son canales iónicos específicos que median la penetración de iones de Ca^{2 +} en las membranas del retículo sarcoplásmico (SR) en las células musculares. Por lo tanto, juegan un papel importante en la contracción excitación proceso de acoplamiento. En su forma funcional, la RyR monta como un homo-tetrámero con una masa molecular de > 2 MDa, con cada subunidad compuesta por residuos del aminoácido del ~ 5000. En los mamíferos, existen tres isoformas: RyR1 de tipo músculo esquelético, músculo cardiaco tipo de RyR2 – y RyR3-ubicuo se expresa en diferentes tejidos¹.

En insectos hay un único tipo de RyR, que se expresa en el tejido muscular y nervioso². RyR insectos es más similar a los RyR2 mamíferos con una identidad de secuencia de aproximadamente 47%³. Diamida insecticidas dirigidos a RyR de lepidópteros y coleópteros se han desarrollado y comercializado por grandes empresas como Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) y Syngenta (cyantraniliprole). Desde su reciente lanzamiento, diamida insecticidas se han convertido en uno de la clase de más rápido crecimiento de insecticidas. Actualmente, las ventas de estos tres insecticidas cada año han cruzado 2 billones de dólares con una tasa de crecimiento de más del 50% desde 2009 (Agranova).

Recientes estudios han reportado el desarrollo de resistencia en los insectos después de algunas generaciones de uso de estos insecticidas^4,5,6,7,8. Las mutaciones de la resistencia en el dominio transmembrana de RyRs de la polilla del diamondback (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) y las posiciones correspondientes de minador del tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) muestran que la región podría participar en el enlace de insecticida diamida como esta región es conocida por ser crítica para la compuerta del canal^4,8,9. A pesar de extensas investigaciones en esta área, los mecanismos moleculares exactos de diamida insecticidas permanecen fuera de alcance. Por otra parte, no está claro si las mutaciones de resistencia afectan las interacciones con diamides directamente o allosterically.

Estudios anteriores han reportado la estructura de varios dominios de RyR de especies de mamíferos y la estructura de cuerpo entero RyR1 mamíferos y RyR2 por cristalografía de rayos x y microscopia del cryo-electrón, respectivamente^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Pero hasta el momento, ninguna estructura de insecto RyR se ha divulgado, que nos impide entender los entresijos moleculares de la función del receptor, así como los mecanismos moleculares de acción insecticida y el desarrollo de resistencia a los insecticidas.

En este manuscrito, presentamos un protocolo generalizado para la caracterización estructural de dominio β-trébol de N-terminal del receptor de rianodina de palomilla, una plaga destructiva que infectan cultivos crucíferas a nivel mundial²². La construcción fue diseñada según el conejo publicado RyR1 NTD cristal estructuras^23,24y cryo-EM modelos estructurales^{16,17,18,19, 20 , 21}. esta es la primera estructura de alta resolución para insectos RyR, que revela el mecanismo de compuerta canal y proporciona una plantilla importante para el desarrollo de insecticidas específicos usando el diseño de fármacos basado en estructura. Para la aclaración de la estructura, se empleó Cristalografía de rayos x, que se considera como el gold standard para la determinación de la estructura de proteínas en cerca de resolución atómica. Aunque el proceso de cristalización es impredecible y mano de obra, este protocolo paso a paso le ayudará a los investigadores a expresar, purificar y caracterizar otros dominios de insecto RyR o cualquier otras proteínas en general.