Struttura di cristallo del dominio N-terminale del recettore Ryanodine da Plutella xylostella

Recettori della rianodina (RyRs) sono canali ionici specifici, che mediano la permeazione degli ioni Ca^{2 +} attraverso le membrane del reticolo sarcoplasmatico (SR) nelle cellule muscolari. Di conseguenza, giocano un ruolo importante nel processo di accoppiamento eccitazione contrazione. Nella sua forma funzionale, RyR monta come un homo-tetramero con una massa molecolare di > 2 MDa, con ogni unità secondaria che contengono residui dell’amminoacido ~ 5000. Nei mammiferi, ci sono tre isoforme: RyR1 – tipo di muscolo scheletrico, muscolo cardiaco tipo di RyR2 – e RyR3-ubiquitariamente espressa in diversi tessuti¹.

Negli insetti c’è un solo tipo di RyR, che si esprime nel tessuto muscolare e nervoso². Insetto RyR è più simile a mammiferi RyR2 con un’identità di sequenza di circa il 47%³. Insetticidi di diammide targeting RyR di lepidotteri e coleotteri sono stati sviluppati e commercializzati da importanti aziende come Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Dal suo lancio relativamente recente, diammide insetticidi sono diventati uno della più rapida crescita classe di insetticidi. Attualmente, le vendite di questi tre insetticidi annualmente hanno attraversato 2 miliardi di dollari con un tasso di crescita di oltre il 50% dal 2009 (Agranova).

Gli studi recenti hanno segnalato lo sviluppo di resistenza negli insetti dopo poche generazioni di utilizzo di questi insetticidi^4,5,6,7,8. Le mutazioni di resistenza nel dominio del transmembrane di RyRs dal diamondback moth (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) e le corrispondenti posizioni in pomodoro minatrice, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostrano che la regione potrebbe essere coinvolto nel legame di insetticida diammide come questa regione è conosciuta per essere critico per gating del canale^4,8,9. Nonostante approfondite ricerche in questo settore, i meccanismi molecolari esatti di insetticidi diammide rimangono evasivi. Inoltre, non è chiaro se le mutazioni di resistenza riguardano le interazioni con diamides direttamente o allosterico.

Precedenti studi hanno segnalato la struttura dei diversi domini di RyR da specie di mammiferi e la struttura del full-length dei mammiferi RyR1 e RyR2 di cristallografia a raggi x e microscopia crio-elettronica, rispettivamente^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Ma finora, nessuna struttura di insetto RyR è stata segnalata, che ci impedisce di comprendere le complessità molecolare della funzione del ricevitore come pure i meccanismi molecolari di azione insetticida e lo sviluppo della resistenza agli insetticidi.

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo generalizzato per la caratterizzazione strutturale del dominio β-trifoglio N-terminale del recettore rianodinico dal diamondback moth, un parassita distruttivo infettare crocifere colture in tutto il mondo²². Il costrutto è stato progettato secondo il coniglio pubblicati RyR1 NTD cristallo strutture^23,24e cryo-EM modelli strutturali^{16,17,18,19, 20 , 21}. Questa è la prima struttura ad alta risoluzione segnalata per insetto RyR, che rivela il meccanismo per canale gating e fornisce un modello importante per lo sviluppo di specie-insetticidi utilizzando Progettazione di farmaci basati su struttura. Per delucidazione della struttura, abbiamo impiegato la cristallografia a raggi x, che è considerato come il ‘gold standard’ per la determinazione della struttura della proteina a vicino a risoluzione atomica. Anche se il processo di cristallizzazione è imprevedibile e alta intensità di manodopera, questo protocollo passo-passo vi aiuterà i ricercatori di esprimere, purificare e caratterizzare altri domini di insetto RyR o qualsiasi altre proteine in generale.