JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Published: November 05, 2018
doi:
10.3791/58538
, , ,
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry,University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry,University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry,University of Alberta

Summary

Burada, nasıl küçük açı X-Ray saçılma (SAXS) düşük çözünürlüklü zarflar makromoleküllerin yapıları temsil eden hakkında bilgi edinmek için kullanılması gereken mevcut. X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikleri ile birlikte kullanıldığında, SAXS detaylı yorumlara çok etki alanlı proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri çözüm sağlayabilir.

Abstract

Protein-protein etkileşimleri proteinler birden çok küresel etki alanlarıyla ilgili nasıl böyle kompleksleri form ve nasıl etki alanlarında odaklı/konumlandırılmış belirlemek için teknik sorunlar mevcut. Burada, hangi belirli etki alanları aracılık etkileşimleri aracılığıyla ab initio modelleme uygulamasının sisteminde elucidating için potansiyel bir protokolle açıklanmıştır. Bu küçük açı X-ray saçılma (SAXS), kromatografi ve atomik çözünürlükte yapılar birlikte bir melez yaklaşım verilerden tümleştirme içerir çözüm yapıları oluştururlar ve kendi meclisleri hesaplamak için bir yöntem sağlanmıştır. Belirli bir örnek tam uzunlukta nidogen-1, hücre dışı matriks proteinleri birleştirir ve bir genişletilmiş, kavisli nanostructure formları karmaşık ilgilidir. Onun küresel etki alanlarından biri laminin γ-membran yapılar 1 için ekler. Bu esnek çok etki alanlı protein kompleksleri doğru yapılarının belirlenmesi için bir temel sağlar ve Otomasyon Robotik ve boyutu dışlama Kromatografi Sistemleri ile birleştiğinde sinkrotron kaynaklar tarafından etkinleştirilir. Bu kombinasyon birden fazla oligomeric durum sadece SAXS veri toplama önce ayrıldığı hızlı analiz sağlar. Analiz eylemsizlik, parçacık boyutu, moleküler şekli ve etki alanları arasında eşleştirme yarıçapı hakkında bilgi verir. Protokol bileşeni proteinlerin yüksek çözünürlüklü yapıları yaklaştırarak kompleksleri 3D modeller oluşturmak için de verilir.

Introduction

Karmaşık ağları cascades sinyal ve yapısal bütünlüğünü korumak gibi hücresel işlevler yürütmek için Moleküler makineler olarak hareket proteinlerin hücre içeriyor. Bu farklı bileşenleri taşımak ve üç boyutlu uzayda etkileşim yolları açmaktadır oluştururlar belirli işlevleri için. Protein yapısı, dinamiği ve etkileşimleri işlevi belirlemede önemi bu özellikleri ölçmek sürekli gelişen, karmaşık teknikleri gerek sağlamıştır. Bunlar nükleer manyetik rezonans (NMR), x-ışını kristalografisi (XRC) ve daha yakın zamanda, Cryo-elektron mikroskobu (CEM) sağlamak yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi. Ancak, XRC ve CEM birçok biyomoleküler durumlardan yapılarının verim ve 3D yapı belirlenmesi NMR tarafından daha küçük globüler proteinler için genellikle sınırlı olmakla birlikte protein yapısının mekanizmaları hakkında bilgi eksikliği. Bu sınırlamaları aşmak için bir yol küçük açı X-Ray saçılma (büyük, çoklu etki alanı veya complexed sistemlerinin moleküler zarf oluşturmak ve global aydınlatmak için yüksek çözünürlüklü katı makromoleküllerin yapılarının birleştirmek için SAXS) kullanmaktır yapısı ve dinamik özellikleri.

SAXS fikir değil sadece yapısı aynı zamanda karmaşık görüntüler dinamik özellikleri içine veren makromoleküllerin kompleksleri düşük çözünürlüklü zarflar yaklaşık 10-20 Å 1, çözünürlüğe sahip üretir. SAXS moleküler yapısı ortaya çıkarmak için röntgen kullanır, çözüm parçacıkları rasgele izotropik yönünü kırınım ama atomik çözünürlük verim cant saçılma oldukça yol değil bu XRC olsa da. Bunun yerine, bir elektron “zarf” makromolekül makromolekül görüntüler biçimler ortalama temsil eden oluşturulur. Bu bilgiler daha önce çözüldü atomik çözünürlük yapıların doğrudan uydurma bölgelerinde esneklik tek protein veya alt birimi kuruluş veya daha büyük, çok protein kompleksi dinamiklerini anlaması için kullanılabilir. SAXS veriler yüksek enerjili monokromatik x-ışınları kullanarak synchrotrons veya örnek çekim hızı (Şekil 1) saniye yerine saat gerektiren daha zayıf bir x-ışınları kaynak teklif şirket içi kaynaklardan toplanmıştır. SAXS veri kez toplanan bir tek deneysel tertibat ve arabellek, bir sistemde bir tur yararlı veri toplamak için uzun bir süre gerektiren çeşitli örnekleri. Örnekleri bu nedenle doğrulanabilir kalite kontrol yöntemleri dinamik ışık saçılma (DL) ve/veya yüksek kaliteli SAXS veri2 ‘ yi edinmek için analitik ultracentrifuge (AUC) analizi gibi temel alan en az bir kaç saat için istikrarlı ve sigara toplayarak olmalıdır , 3. burada SAXS, ilkeleri, kullanımı, yararları, sınırlamalar ve numune hazırlama ve odak ağır üzerinde veri toplama ve analizi, arkasında pratik bir açıklaması ile birlikte kullanarak modelleme kısaca üzerinde ab initio sağlamak hücre dışı matriks proteinleri nidogen-1 ve laminin γ-1 deneysel örnek olarak.

İlkeler, faydaları ve sınırlamaları SAXS:

SAXS arkasında yol gösterici principle(s) oldukça basittir: bir çözüm macromolecule(s) ilgi monodispersed hazırlanması bir kılcal içinde yerleştirilir ve yüksek enerji monokromatik röntgen ışını maruz kalmaktadır. Fotonlar elektronların atom kabuk salınan, başlamak için küresel bir dalga dalga boyu aynı enerji ve yayılan neden. Her elektron salınım beri sürekli bir arka plan elde ve makromolekül ortaya çıkan elektron yoğunluğu arka plana tezat. Elde edilen saçılım yoğunluğu saçılma açı, 2Θ bir fonksiyonu olarak toplanır (Şekil 1).

Diğer teknikleri XRC, NMR ve CEM atomik düzeyde yapısal bilgi sağlamak gibi diğer teknikleri sağlayamaz SAXS için birden çok faydası vardır. SAXS hemen hemen her arabellekte gerçekleştirilebilir ve herhangi bir özel numune hazırlama gerektirmez. Bu davranış ve yapısını oluştururlar varlığı ya da yokluğu mono – veya divalent katyonlar veya pH4,5değişimler gibi çeşitli koşullarda eğitim özellikle önemlidir. SAXS bir makromolekül6, listelenen diğer teknikleri ile mücadele bir şey esnek bölgeleri hakkında bilgi sağlama yeteneği vardır. Güçlü bir ücretsiz teknik bir makromolekül olmanın istikrarlı bölümleri XRC, NRM veya CEM ve tüm makromolekül okudu veya karmaşık SAXS ile düşük çözünürlüklü analiz ve çeşitli analiz araçları gibi kullanarak kombine olarak SAXS bu nedenle, kullanılabilir FoXSDock7 veya CRYSOL8. SAXS bir çözüm teknik olduğundan, genellikle statik yapının XRC elde edilen bu gibi çözüm6‘ tutarlı olup olmadığını onaylamak için kullanılır. SAXS da örnek yatırım (genellikle 50-100 µL) nispeten az miktarda ve deney süresi (30 dk – 1 h) nispeten az miktarda gerektirir bir teknik olmanın avantajı var.

En büyük SAXS örnek toplama ve/veya yanlış yapısal Öngörüler için yol açabilir bozulması güvenlik açığı kısıtlamasıdır. Bir toplama, hatta %5, düşük ışık maksimal Parçacık boyut (Dmax) ve eylemsizlik (Rg) yarıçapında bir tahmindi lider çok yüksek miktarlarda dağılım. Öte yandan, örnek bozulması moleküler özelliklerini bir hafife için yol açabilir. Bu güvenlik açığından örnek homojenliği güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmesi için kritik olduğu anlamına gelir bir ortalama tekniği olmak SAXS kaynaklanmaktadır. SAXS tarafından analiz edilecek olan herhangi bir örnek bu nedenle, arıtma ve homojenliği çek, denaturing ve yerel Jel Elektroforez, boyutu dışlama kromatografi, dinamik ışık saçılma, gibi birden çok yöntem geçmesi ve analitik ultrasantrifüj. Genellikle, SAXS beamlines örnekleri son kalite kontrol olarak yüksek performanslı sıvı kromatografi ile adım SAXS (S-SAXS)3,9önce çalışır. SAXS veri birden çok konsantrasyonları toplanmalıdır ve her veri kümesinin Rg interparticle etkileşim ve toplama, hangi bir tahmindi parçacık içinde sonuçları önlemek için yakın bir benzerlik sağlanması karşılaştırılması gereken Boyutlar, lider hatalı veri analizi ve modelleme. Saçılma konsantrasyon ve boyutu üzerinde bağlı olduğundan daha küçük oluştururlar konsantrasyon aralığı daha ayrıntılı bir optimizasyon gerektirebilir. Bu nerede küçük açılar ve küçük boyutlarda geniş açı doğru doğru büyük boyutlarda dağılım Karşılıklılık teoremi, kaynaklanmaktadır. Bu veri toplama, benO nerede R-6, orantılı R parçacık RADIUS nerede ortaya çıkar. Bir son SAXS örnek radyasyon zarar potansiyeli için verilerin bozulma yol açabilir pozlama sırasında kısıtlamasıdır. Önce ve sonra SAXS örnek maruz kalma bu değil oluştuğunu emin olmak için örnek kalite karşılaştırmak için iyi bir yöntemdir.

Protocol

1. SAXS örnek hazırlama ve veri toplama Numune hazırlama: SAXS deneyler homojen, istikrarlı ve sigara toplayarak protein örnekleri gerektirir; istikrar ve boyutu dışlama Kromatografi (S), oligomeric durumuyla gözlemlemek DLS ve/veya veri toplama önce AUC. Konu örnekleri (nidogen-1 ve laminin γ-1 Bu durumda) DLS analiz ve tricine örnek saflık10görselleştirmek için SDS-sayfa.Not: Örnekleri konsantrasyonları (1-4 mg/mL) bağlı olarak büyüklükleri, çözüm davranışlarını kendi kendine Derneği ve istikrar birlikte toplama gibi bir dizi kapsayabilir; burada, nidogen-1, (139 kDa), beş konsantrasyonları laminin γ-1 (109 kDa) ve dört S saf ekimolar kompleks yukarıda açıklanan10hazırlanmıştır. Veri toplama: Toplama SAXS verileri bir in-house sistemi veya sinkrotron, üretici veya tesis kurallarına göre.Not: Bu çalışmada kullanılan veriler bir in-house sistemi kullanılarak toplanmıştır ( Tablo malzemelerigörmek) içeren bir 3-pinhole fotoğraf makinesi ile donatılmış + 002 microfocus tüp kapalı (Cu Kα radyasyon 1.54, Å) ve 40 W. işletim Confocal Max-Flux (CMF) optik Sistem aynı zamanda bir 200 nm çok tel 2D dedektörü veri toplama için donatılmıştır. Ancak, Fransa, Almanya, İngiltere, ABD ve diğer ülkelerde de modern synchrotrons durumu ile hangi ayrılması mümkün toplama/bozulması, biz şimdi üzerinden bir monodispersed hazırlık rutin kolaylaştırır bir S-SAXS kurulum erişim sağlar sinkrotron tesislerinde veri toplamak. Bir S-SAXS veri toplama stratejisi örneği olan bir DNA G-dörtlüsü11 kısa bir süre önce bir madde. Bu durumda, SAXS veri nidogen-1 için 3 saat 0,08 ≤ q ≤ 0,26 Å aralığında toplanmıştır (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 ve 4.0 mg/mL); laminin γ-1 (1,5, 2.0 ve 2,5 mg/mL) ve onların karmaşık (0.8, 1.0, 1.25 ve 1.5 mg/mL). Veri arabellek ve işleme yazılımı sisteme özgü kullanarak örnekleri için azaltmak. PRIMUS/qt12 (Şekil 2A) gibi bir program kullanarak protein verilerinden bir arabellek katkı çıkarma. 2. veri analizi Not: Şu anda SAXS veri analizi için yararlı olan bir kaç yazılım paketleri vardır: ScÅtter43 (download www.bioisis.net elde edilebilir), bioXtas ham44ve ATSAS suite13. Bu bölüm belirli adımlar ATSAS 2.8.1 alınır ve ham SAXS analiz ATSAS kullanarak veri suite programı gerçekleştirilecek genel adımları genel bir bakış sağlar download. Diğer programlar kullanılabilir ve kısa bir süre sonra ele alınmıştır. Arabellek çıkarmaNot: Aşağıdaki adımları yalnızca statik SAXS örnekleri ilgilidir. PRIMUS/qt içinde “Açık” menü seçeneğini seçin ve ilgi veri dosyalarını seçin. Veri dosyaları ilk sütun s-vektör eksen olan ASCII biçiminde olmalıdır ve ikinci sütunun yoğunluğu olduğunu unutmayın. Arabellek için bu verileri aynı menüsüne ekleyerek toplanan veriler için bu adımı yineleyin. “Çıkart” sadece faiz makromolekül saçılma temsil eden bir subtracted saçılma eğrisi oluşturur veri işleme penceresinde seçin. Her toplama için bu adımı yineleyin. Guinier Analizi Guinier analiz gerçekleştirmek için bir arabellek düşülen dağılım eğrisi PRIMUS/qt adım 2.1.1 daha önce açıklandığı gibi yükleyin. “Radius, hangi Primus Guinier Sihirbazı; açılmasına devam edecek eylemsizlik” tıklayın bir komplo ln(I) vs q2 -ecek var olmak göstermek. Ön Rg elde etmek için yapılı bir dış ölçü birimi PRIMUS/qt. aranan “Autorg” düğme ve tıkırtı “AUTORG” fonksiyonunu kullanın. Birden fazla dosya aynı anda onları menünün sağ tarafında 2.1.1 için çok benzer içine ekleme ve hepsini vurgulayarak girdi. Veri kalitesi değerlendirmek için önceki oluşturulan Guinier Arsa kullanın; yeşil hat Guinier Arsa altında uygun bir doğrusallık temsil eden kalanlar Arsa gösterir. Guinier analizde non-lineer örnek toplama bir belirtisi olabilir ve daha fazla çözümleme bu durumda gerçekleştirilmesi gereken değil unutmayın.Not: Bir doğrusal Guinier uyum bir Rg ile küçük bir hata verir (< % 5) ve yüksek kaliteli örnek göstermektedir. Kratky Analizi Yukarıda açıklandığı gibi benzer bir şekilde görüntülenmeyecektir için verileri yüklemek. “Seçin”yanındaki kutuyu veri dosyasının adını tıklatın. Bu verileri ayrı bir pencerede çizmek. Açılan menüde “Kartky komplo” seçim ardından “Komplo” düğmesini tıklatın. Bu “q2 x L(q) vs q” olarak verileri çizmek. Süre gelişeceğini proteinler bir plato yerine bir tepe görüntülemek ve bir hiperbolik Arsa17benzer globüler proteinler bir Gauss tepe görüntülemek unutmayın. Veri birleştirme Yük arabellek veri PRIMUS/qt her konsantrasyon için bir kez daha, adım 2.1.1 olduğu gibi çıkartılır. Verileri birleştirmek için işlem penceresinde “Birleştirme” düğmesini tıklamanız yeterlidir. Her eğri ve ben orijinal örnekten yapılan dilutions ilişkili olan ölçek numarasını kontrol edin.Not: Örnekleri, daha yüksek konsantrasyon eğrileri kuyruk bölgede daha az gürültü görüntüler. P(r) dağıtım P(r) Arsa üretmek için birleştirilmiş verilerin eğrileri PRIMUS/qt daha önce açıklandığı gibi yükleyin. Sağ tarafında dağınık ışık vs q ve çift-mesafe dağıtım işlevini Arsa yoğunluğunu birleştirilmiş veri sunan yeni bir pencere açmak için “Mesafe dağıtım” düğmesini tıklayın.Not: Çift-mesafe dağıtım işlevi hesaplamaları genel kalitesini sağ tarafı hakkında bilgi verir. Ham veri kuyruk sonunda herhangi bir önemli sesini önlemek için birleştirilmiş veri veri aralığını ayarlayın. Veri noktaları düşük-q bölgesindeki kiriş stop yakın atlayın. Bir dizi Guinier analizinden elde edilen 5 kat ~ Rg Dmax, başlangıç belirlemek için. P(r) Arsa aniden sıfıra y ekseni üzerinde bırakma değil ve uzun kuyruklu sıfır yaklaşırken önce yok kadar yavaş yavaş bu değeri azaltmak. Bu kontrol deneysel Rg/ben0 (Guinier yaklaşım türetilmiş) ve P(r) Rg/ben0benzer sayılardır.Not: bazı durumlarda, daha fazla veri, veri noktaları ve alfa (hangi program ne kadar dikkat deneysel verilerin uygun için karşılaştırıldığında dağıtım düzgünlüğünü ödenir oranı söyler regularization parametre) dizi manipülasyon da gerekli21 kaliteli P(r) Arsa almak için. 3. ab Initio boncuk modelleme ve ortalama Birden çok konsantrasyonları toplanan veri birleştirilir, ya da S-SAXS kullanarak toplanan verileri en aza indirilir ve Kratky arsa, P(r) Arsa ve Guinier analiz doğrulandıktan sonra düşük çözünürlüklü yapıları oluştururlar hesaplamak ve kendi kompleksleri. Bu boru hattı çalışma çözüm yapıları ve nükleik asitler, proteinler ve nükleik asitler protein veya protein-protein kompleksleri10,11,21,22,23 etkileşimleri için kullanılabilir ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34. DAMMIN Svergun35 ve Benzetimli Tavlama protokolleri Rg ve Dmax ön giriş bilgi ile istihdam ATSAS paket13, bir parçası tarafından geliştirilen, en popüler programlarından biridir . Ab initio modelleme yaklaşımlar ve ilkeleri açıklanmıştır ayrıntılı olarak başka bir yerde18,36.

Representative Results

Yukarıda açıklanan veri analizi yaklaşımı Rg ve Dmax nidogen-1, laminin γ-1 ve P(r) işlevini kullanarak kendi kompleksi için hesaplamak için kullanılmıştır. 7,20 (±0.10) nm, 8.10 (±0.20) nm ve nidogen-1, laminin γ-1 ve onların karmaşık 10.9 (±0.4) nm Rg değerleri sırasıyla elde (Şekil 2A-B). Buna ek olarak, Dmax değerleri 24 nm, 26 nm ve 35 nm nidogen-1, laminin γ-1 ve onların karmaşık için sırasıyla elde (Şekil 2)10 . DAMMIF programı nidogen-1 ve laminin düşük çözünürlüklü yapılar elde etmek için kullanılan γ-1, her iki protein çözüm Genişletilmiş şeklinde kabul önerdi. Nidogen-1 (~ 1 ve 0.8) ve laminin γ-1 X ve NSDAP değerleri (~0.9 ve 0.8 sırasıyla) kabul edilebilir aralıkta da vardı. Yüksek çözünürlüklü yapıları hizalamasını, nidogen-1’in iki etki alanı ve iki laminin γ-1, SAXS kullanılarak elde onların düşük çözünürlüklü yapıları üzerinde onların N ve C terminali bölgeleri10tanımlaması izin. Nidogen-1 laminin γ-139,40 etkileşen bir ortağı olarak tespit edildi ve etkileşim sitesi C-terminal etki alanları41x-ışını kristalografisi kullanarak eşlendi. Ancak, yüksek çözünürlüklü yapıları sadece etkileşen etki alanları değil, tam uzunlukta nidogen-1 veya tüm laminin γ-1 kol dahil. Bu nedenle, bir karmaşık içeren nidogen-1 (tam boy) ve laminin γ-1 kol etkileşen bölgeler de N-terminal etki alanları her iki protein göreli yönünü çalışma olarak tanımlamak için saf. SAXS veri kompleks için bir Rg 10.9 (±0.4) nm ve bir Dmax 35 vermiştir nm. Biz MONSA etki alanları geri kalanı çok birbirlerine dışında ( ise gerçekten de, sadece iki protein C-terminal bölgesi etkileşimleri, arabuluculuk alması önerilen tüm karmaşık düşük çözünürlüklü yapısını elde etmek için kullanılan Şekil 3, Video 1). Şekil 1. Şemaları SAXS tuzak. Yüksek enerjili x ışınları ile pozlama ardından biomolecules veya kendi kompleksleri monodispersed hazırlanması hazırlanır. (Örneğin, şirket içi vs sinkrotron) kaynağına bağlı olarak, x-ışınları ve örnek kaynak mesafe için enerji değişebilir. (Bu biomolecules şekli ve boyutu bağlıdır) röntgen saçılma desen kaydedilir ve radyal saçılma açı ile ilgili olarak dağınık ışık yoğunluğu hakkında bilgi içeren bir 1 boyutlu çizim (1 D) elde etmek için Ortalama olarak. Arabellek moleküller de ışık dağılım gibi bu moleküller katkılarıyla bir saçılma kalıp biomolecules ilgi ile elde etmek için çıkarılan. SAXS veri toplama önce sinkrotron, satırdaki boyut dışlama/yüksek performanslı Kromatografi kullanarak bir ek arıtma adım da genellikle gerçekleştirilir (en iyi görünümü). İlişkisiz herhangi bir biomolecules karmaşık kaldırmak için herhangi bir araya getirilmiş ve/veya bozulmuş ürün kaldırmak için kritik bir adımdır. 1D saçılma Arsa Eylemsizlik yarıçapı ve biomolecules en büyük parçacık boyut sağlayan elektron çifti-mesafe dağıtım arsa için (P(r) arsa) dönüştürülür. Bu arsa için paketleri (Yani, DAMMIN/DAMMIF) modelleme ab initio girdi dosyası olarak biomolecules veya diğer paketleri (Yani, SASREF/mercan) düşük çözünürlüklü yapıları elde etmek için kullanılan yüksek çözünürlüklü yapı bölümlerinin biomolecules veya kompleks bireysel biomolecules bilinir.  Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2. (A) dağınık ışık vs saçılma açı bir yoğunluk bir arsa (q = 4πsinθ/λ, nm-1) biomolecules (düşük bölge) ve biomolecules (yüksek bölgesi) şeklinde kalitesini öne. (B) elektron çifti-mesafe dağıtım saçılma verilerden belirlenir P(r) biomolecules soruşturma (laminin γ-1, nidogen-1 ve onların karmaşık) altında uzun bir şekil öneririz. (C) Kratky bu nidogen-1 Arsa düşündüren ve laminin γ-1 proteinler gelişeceğini değildir. (D) nidogen-1, laminin γ-1 için Guinier çizim ve düşük-saçılma açıyla verileri kullanarak Eylemsizlik yarıçapı tespiti için doğrusal bölge gösteren onların karmaşık. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3. Nidogen-1 ve laminin γ-1 programı MONSA kullanarak birleştirilen veri kümesi analizi ile elde edilen kompleks düşük çözünürlüklü yapısını. Renk düzenini Şekil 2ile aynıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Video 1. Nidogen-1 ve laminin düşük çözünürlüklü yapısı γ-1 karmaşık. Bu film karmaşık çeşitli yapısal özelliklerinden görselleştirmek için PYMOL kullanarak hazırlanmıştır. Laminin-nidogen kompleks kristal yapısı (PDB ID: 1NPE) gösterilir şerit çizgi film etkileşim vurgulayarak bu kompleks için siteleri. Renk düzenini Şekil 2ile aynıdır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Discussion

Bu kağıt ekle arabellek çıkarma, Guinier analiz, Kratky analiz, veri birleştirme ve P(r) dağıtım protokolü bölümünde özetlenen SAXS veri analizi kritik adımlar. Ab initio boncuk modelleme burada ayrıntılı olarak ele alınacak çok geniş ve bu nedenle yalnızca kısa bir süre kaplı olmasıdır.

(Örneğin Almanya’da DESY, elmas İngiltere’de ve Fransa’da ESRF) synchrotrons, çok küçük bir kısmı için SAXS veri toplamak mümkündür (~ kaç µL) kesirler olarak her örneğinin s sütundan eluted yani bağlı satır içi (bkz: resim 1 ). Melosun dağınık SAXS veri radyal arabellek çıkarma yer almadan önce araç üreticisi veya sinkrotron tarafından sağlanan paketleri kullanarak ortalama. Elde edilen 1D veri miktarını dağınık ışık ( ben(q)) Ytemsil-eksen ve saçılma açı (q= 4πsinθ/λ λ dalga boyu olay Xnerede,-ışınları) ve Şekil 1‘ de özetlenen. PRIMUS/qt12 program doğrudan arabellek nedeniyle herhangi bir arka plan çıkarmak için kullanılır ve 1.1 bölümünde anlatılan. Diğer programları gibi; ScÅtter43 (download www.bioisis.netelde edilebilir) bir eğitim elde edilebilir vasıl https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAve bioXtas ham44 (elde edilebilir vasıl https:// ile bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) ATSAS paketi alternatif olarak kullanılabilir.

Guinier analiz örnek toplama ve homojenliği olarak Eylemsizlik yarıçapı (Rg) düşük s bölge14SAXS verileri esas ilgi makromolekül için bilgi sağlar. Bir komplo PRIMUS/qt ile ilâ 1,30 q için azami menzili ile uygun eğrisi ve ardından her konsantrasyon, elde edilen SAXS veriler için inşa edilmiştir Rgx. Doğrusal olmayan bir Guinier toplama sonuçları15,16çizmek ise monodispersed numune hazırlama (Şekil 2B), bu bölgede bir doğrusal Guinier Arsa sağlamalıdır. Guinier analiz doğrusal ise, “unfoldedness” bir makromolekül ilgi derecesini katı vücut modelleme gerçekleştirmek veya düşük çözünürlüklü modellerin topluluklar oluşturmak karar verirken yararlı olan Kratky komplo ile görülebilmektedir. Küresel bir protein molekülleri genişletilmiş, ancak Çan şeklinde bir eğri arsa veya gelişeceğini peptidler Plato hatta daha büyük q aralığında artış ve bell-şekil (Şekil 2C) eksikliği görünür bir Kratky görünür.

Rg Guinier analizinden elde yalnızca 1 D dağılım çizim (Şekil 2B) düşük q bölgesinden veri noktaları dikkate alır, ancak, dolaylı bir Fourier dönüşümü gerçekleştirmek için neredeyse tüm veri kümesi kullanmak mümkündür Dmax ve Rg üzerinde bilgi sağlayan bir gerçek uzay mesafe dağılım fonksiyonu (P(r)) ln (ı (q)) vs (q) karşılıklı yer bilgileri dönüştürmek için (Şekil 2B) P(r) arsa şeklini faiz18,19makromolekül brüt çözüm biçimi temsil eder. karşılıklı-alan veri dönüştürme gerçek alanı veri kritik bir adımdır ancak ayrıntılı bir açıklama bu kağıt kapsamında değildir. Bu nedenle, her parametre anlamak için Svergun20 tarafından bir makaleye bakın.

Arabellek düşülen bir kez bireysel konsantrasyonları Guinier analizi ile istikrarlı bir değer ile Kratky analizi ile onların katlama desen inceleyerek takip Rg, işlenen veri, bu veriler birleştirilebilir. Birleştirilen verilerin nidogen-1, laminin γ-1 ve onların karmaşık yukarıda açıklandığı gibi işlenmiş olan ve elde edilen P(r) araziler için 2B şekilsunulmaktadır. İdeal olarak, bir de çift-mesafe dağılım fonksiyonu benzer Rg ve Dmax değerleri her konsantrasyon için toplanan SAXS veri sağlar olup olmadığını belirlemek için P(r) her yoğunlaşması hesaplamak. Rg ve Dmax benzer konsantrasyonları geniş bir aralığında kalırsanız, Kullanıcı devam etmek. Bu veri birleştirme önce sinyal bağlı olarak, veri kesilmiş unutulmamalıdır. Konsantrasyonları ve/veya soruşturma altında oluştururlar molekül ağırlığı düşük ise bu kez durum.

Düşük çözünürlüklü şekil analiz DAMMIN kullanarak çeşitli modlarda yapılabilir (Örneğin hızlı, yavaş, uzman modu, vb). Hızlı mod P(r) Arsa kaliteli modelleri sağlıyorsa değerlendirmek için ideal bir ilk adımdır. Tipik olarak, en az 10 modelleri tekrarlanabilir sonuçlar, düşük çözünürlüklü yapısı açısından, sığdır değiştirgesi χ (0,5-1,0 değeri bizim kapsamlı çalışmaları temel iyi olarak kabul edilir olarak adlandırılan düşük bir iyilik ile elde edilen Eğer kontrol etmek her P(r) arsa için elde ), deneysel olarak toplanan SAXS veriler ve model alınan verileri arasında bir anlaşma açıklar değeri. Yayın amaç, biz genellikle yavaş ya da uzman modu kullanın ve en az 15 modelleri hesaplamak. DAMMIN ek olarak, o, DAMMIF37, hem hem GASBOR38 daha hızlı bir versiyonu da alternatif vardır. Ayrıca, protein-protein veya protein nükleik asit kompleksleri çalışmaya, hem oluştururlar, hem de onların karmaşık için bireysel SAXS verilerin eşzamanlı uygun kolaylaştırır MONSA programı35, kullanmak mümkündür. RNA-protein etkileşim çalışmaları için de yüksek çözünürlüklü modeli hesaplamalar hakkında daha fazla bilgi için Patel ve ark3tarafından son bir makaleye bakın.

SAXS teorik olarak basit ama hiç şüphesiz çok tamamlayıcı bir yöntem diğer yapısal biyoloji araçları ve sonuçları kendi başına kullanılabilir düşük çözünürlüklü yapısal veri veya bilgi aydınlatmak için yüksek çözünürlüklü teknikleri ile birlikte makromoleküllerin yapısı ve dinamikleri hakkında. Monodispersed hazırlanması oluştururlar ve kendi kompleksleri elde edilebilir olduğu sürece, SAXS çözüm yapısı ve etkileşimleri biyolojik makromolekül herhangi bir tür eğitim için yararlı olabilir. Burada tartışılan karmaşık söz konusu olduğunda dikkat çekici o daha az ise her iki proteinlerin etki alanları kalan diğer etkileşim serbestçe erişilebilir azot-1 ve laminin genel olarak erişilebilir yüzey alanı yüzde 10’u bu karmaşık γ-1 gömülü proteinler hücre dışı matriks yapısal sertlik (Şekil 3) korumak için. İle birlikte için bu tür bilgileri almak ~ 240kDa x-ışını kristalografisi, NMR ve Cryo-EM mikroskobu gibi diğer yapısal biyoloji teknikleri kullanarak çok zor olurdu.

X-ışını kristalografisi veya NMR ile ortaya çıkarılması protein yapısı doğal olarak zaman alıcı bir süreçtir. Bu darboğaz yapı belirlenmesi SAXS gücünü yapısal bir teknik olarak gösterir nerede bir alandır; veri toplama bir tek SAXS deneyi için bir saat alabilir ve aerodinamik analiz yazılımı sayesinde, hızlı ve verimli bir şekilde Analizi yapılabilir. SAXS yüksek çözünürlüklü veri kullanılabilir olmadan önce makromoleküllerin yapısı düşük çözünürlüklü bir model sunuyor çünkü tek başına bir teknik olarak yapısal çalışmalar-den geçerek büyük artış potansiyeline sahiptir. Uzun bir süre boyunca yüksek düzeyde protein ifade ve istikrar gerektiren veri toplama son derece saf, konsantre örnek gereksinimini diğer yapısal teknikleri bir engeldir. SAXS da saf ve konsantre olmaya gerek örnekleri, örnek birimleri kabaca 100 iken SAXS analiz için yapısal diğer tekniklerle karşılaştırıldığında nispeten ucuz bir yöntem yapım µL. Ayrıca, bir ek kalite kontrol adım sağlayan boyut dışlama kromatografi ile birleştiğinde SAXS giderek yaygın hale geliyor. Son zamanlarda esnek sistemleri aydınlatmak için Ensemble optimizasyonu yöntemi (EOM)45,46 kullanarak verileri NMR ve SAXS birlikte güçlü gelişmeler oldu. Mertens ve Svergun47tarafından son bir yazıda, yazarlar NMR, birlikte birçok diğer örnekler NMR ile birlikte kullanılan SAXS veri ile birlikte EOM SAXS birden çok son örnekleri açıklar. Gelişmeler sürekli SAXS alanında yapılmaktadır ve yeni teknikleri ile birlikte kullanılmak üzere SAXS için gelişmiş, değil sadece ücretsiz için yapısal diğer teknikleri. Sonuç olarak, biz SAXS talebi sadece zaman, özellikle içinde dinamik sistemleri işlevleri esneklik tarafından tanımlandığı karakterize NMR ile birlikte artacak inanıyoruz.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje NSERC RGPIN-2018-04994, kampüs Alberta yenilik programı (RCP-12-002 C) ve Alberta Prion Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen / Alberta yeniliklerin Bio çözümleri (201600018) hibe tarzı TRP için layık bir Kanada araştırma sandalyede RNA & Protein Biyofizik (201704) ve NSERC bulma grant (RGPIN-2017-04003) kabul eder. TM finanse edilen NSERC keşif hibe için trp

Materials

HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability – Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare – FPLC System
Nanodrop Nanodrop – Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku – SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd – Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku – Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 – SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 – Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 – Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 – Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 – Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 – Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 – Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd – DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. – The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 – PDB ID: 1NPE
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions?. Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Bioquímica. 38 (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -. P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, n. u. l. l., Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -. H., Wang, J. -. H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).

Tags

Small Angle X-ray ScatteringSAXSStructural StudiesMacromoleculesBiomoleculesBiophysical MethodsStructural BiologyStructure-based TherapeuticsNanoparticlesDrug DeliveryData AnalysisATSAS Software SuiteGuinier AnalysisRadius Of Gyration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image