Dieses Papier berichtet das Protokoll für eine schnelle Identifizierung Assay für Tabak Tabaci basierend auf Loop-vermittelten isothermen (Lampe)-Verstärkungstechnologie. Das Protokoll erfordert minimal Labor Ausbildung und kann, daher, an Grenzübergangsstellen für Pflanze Importe wie Seehäfen und Flughäfen vor Ort umgesetzt werden.
Die Mottenschildläuse Tabak Tabaci (Gennadius) ist eine invasive Schädling von erheblicher Bedeutung, Auswirkungen auf die Produktion von Gemüse und Zierpflanzen Nutzpflanzen in vielen Ländern auf der ganzen Welt. Schwere Ertragsverluste entstehen durch direkte Fütterung, und noch wichtiger, auch durch die Übertragung von mehr als 100 schädliche Pflanze pathogenen Viren. Wie für andere invasive Schädlinge erleichtert mehr internationalen Handel die Ausbreitung von B. Tabaci auf Bereiche jenseits der heimischen Bereich. Kontrollen der Anlage importieren Produkte an Grenzübergangsstellen wie Seehäfen und Flughäfen gelten daher als eine wichtige Präventionsmaßnahme. Diese letzte Verteidigungslinie gegen die Pest Invasionen ist jedoch nur wirksam, wenn schnelle Identifizierungsmethoden für verdächtige Insekten Exemplare verfügbar sind. Da die morphologische Differenzierung zwischen regulierten B. Tabaci und nahe Verwandte ohne Quarantänestatus für nicht-Taxonomen, eine schnelle Identifizierung molekularer Assay anhand der Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (schwierig ist Lampentechnologie) wurde entwickelt. Diese Publikation berichtet das ausführliche Protokoll der neuartigen Assays beschreiben schnelle DNA-Extraktion, Aufbau der Lampe Reaktion und Interpretation seiner auslesen, wodurch B. Tabaci Exemplare innerhalb einer Stunde zu identifizieren. Im Vergleich zu bestehenden Protokolle zum Nachweis von spezifischen B. Tabaci Biotope, die entwickelte Methode richtet sich an die gesamte B. Tabaci Arten Komplex in einem Assay. Außerdem soll der Test vor Ort durch Pflanzen Gesundheitsinspektoren mit minimal Labor Ausbildung direkt an Grenzübergangsstellen angewendet werden. Gründliche Überprüfung durchgeführt unter Labor- und vor-Ort-Bedingungen zeigt, dass die gemeldeten Lampe-Assay eine schnelle und zuverlässige Identifizierung Werkzeug ist, Verbesserung des Managements von B. Tabaci.
Die Mottenschildläuse Tabak Tabaci (Gennadius) ist eine invasive Insekt-Schädling beeinflussen die Ausbeute an vielen wirtschaftlich wichtige Kulturpflanzen wie Zierpflanzen, Gemüse, Körnerleguminosen und Baumwolle1,2. Neben Schäden durch direkte Phloem-Fütterung schadet der Homopteran Arten Pflanzen indirekt durch die Ausscheidung von großen Mengen von Honigtau auf die Oberflächen von Blättern und Früchten, sowie durch die Übertragung von zahlreichen Pflanzen pathogenen Viren1 , 3 , 4. jüngste genetische Studien zum Vergleich von DNA-Sequenzen von mitochondriale Gene Cytochrom c Oxidase 1 (COI) ergab, dass B. Tabaci eine Art ist Komplex von mindestens 34 Morphocryptic Arten3,4. Zwei sehr invasiv und schädlichen Mitglieder innerhalb dieses Komplexes, Biotyp B aus dem Nahen Osten und der asiatischen kleinere Region sowie Biotyp Q mit Ursprung aus dem mediterranen Raum, haben weltweit durch internationalen Handel zerstreut worden Aktivitäten mit pflanzlichen Produkten, insbesondere durch den Transport von Zierpflanzen1,5,6. Wegen seines weltweit Pest die International Union for Conservation of Nature und Natural Resources (IUCN) B. Tabaci als eines der “weltweit 100 schlimmsten invasiver gebietsfremden Arten” und Mitglieder der Gattung komplexe sind regulierte Organismen durch viele Länder1,3,4.
In der Europäischen Union (EU) ist die Pflanze Gesundheit Richtlinie 2000/29/EG Anhang 1AI B. Tabaci entnehmen Sie als ein Quarantäne-Organismus, deren Einführung von nicht-EU-Ländern und deren Verbreitung innerhalb der EU sind,4verboten. Eine wichtige Präventionsmaßnahme gegen die Ausbreitung von Quarantäneorganismen ist die Prüfung von Pflanzenversand an Grenzübergangsstellen (POEs) wie z. B. Flug- und Seehäfen7,8. Im Fall ein Quarantäne-Organismus gefunden wird, die nationalen Pflanze Schutz Organisation (NPPO) verantwortlichen entweder zurückweisen oder Behandlung (einschließlich Zerstörung) der befallenen Versand9vorgeht. Inspektion der Importe oft Offiziere haben jedoch nicht die taxonomische Expertise, genau zu identifizieren, die große Auswahl an Schädlingsarten Welthandel9zugeordnet. Vor allem die Identifizierung von unreifen Lebensphasen (z. B. Eier und Larven) ohne deutliche morphologische Schlüssel ist praktisch unmöglich, für nicht-Taxonomen8,9,10. Infolgedessen um Umsetzung von Quarantänemaßnahmen mit minimaler Verzögerung zu ermöglichen, ist ein Bedarf an Alternativen und schnelle vor-Ort-Identifikation-Assays9.
Eine Kandidat-Methode ist die Loop-vermittelten isothermen DNA-Amplifikation (Lampe) Technologie, die vor kurzem gezeigt hat, eine geeignete Technologie zur Identifizierung der Pflanze Krankheitserreger11,12,13. Lampe ist sehr spezifisch, weil die Methode mindestens zwei Grundierung Paare erkennen sechs unterschiedliche DNA Ziel Sequenzen14verwendet. Aufgrund der DNA-Strang Übersprungshandlung von Bst -DNA-Polymerase werden Lampe Reaktionen unter isothermen Bedingungen14durchgeführt. Daher, im Gegensatz zu herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Tests es besteht keine Notwendigkeit für eine Thermocycler13,14. Ein weiterer Vorteil gegenüber PCR-basierten Tests ist ihre Widerstandsfähigkeit gegen potentielle Inhibitoren in der DNA-Extrakt, umgehen die Notwendigkeit für eine DNA-Reinigung Schritt13. Aufgrund des Protokolls Geschwindigkeit und Einfachheit kann die Lampe sogar unter Bedingungen vor Ort mit einem tragbaren, batteriebetriebenen Echtzeit-Erkennung Gerät8,15durchgeführt werden.
Eine Lampe-Assay wurde als Reaktion auf die Nachfrage für eine schnelle vor-Ort-Bestimmung-Methode für B. Tabaci8entwickelt. Das übergeordnete Ziel war, ein Protokoll zu entwickeln, die von Pflanzen Gesundheitsinspektoren mit begrenzten Labor Ausbildung durchgeführt werden kann. Ein starker Fokus setzte daher auf die Optimierung der Geschwindigkeit und Einfachheit des Protokolls. Während bestehende diagnostische Tests in der Regel für die Identifizierung von einem oder mehreren Biotopen von B. Tabacientwickelt wurden, die neuartige Lampe Assay deckt den gesamten B. Tabaci Arten komplexe8,16,17 ,18. Das Problem der ausgeprägte genetische innerhalb Taxon Vielfalt des Komplexes wurde durch Kombinationen von verschiedenen Primer-Sets und die Anwendung von degenerierten Primern8gelöst. Roman B. Tabaci Lampe Assay ist so konzipiert, dass die Primer ein Fragment am 3′ Ende der mitochondrialen COI gen8Ziel. Dieses Gen stellt ein geeignetes Ziel für tierischen diagnostische Proben, weil es Regionen birgt konserviert ausreicht, um diagnostische Sensitivität für eine bestimmte Art, während anspruchsvolle genug zwischen eng Organismen19, 20. Darüber hinaus das COI-gen dient oft als einen genetischen Marker in Bevölkerung genetische Studien sowie eine Signatur-Sequenz in DNA-Barcoding Analysen, was zu zahlreichen DNA-Sequenz Einträge in open-Source-Datenbanken wie z. B. GenBank und BOLD21 ,22. Neben den öffentlich zugänglichen COI Sequenzen von B. TabaciCOI Sequenzen aus eng verwandten Arten (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton Aceris, Aleurodicus Dugesii, Tabak spp. [N = 3], Neomaskellia Andropogonis, Tetraleurodes Acaciaeund Trialeurodes spp. [N = 4]) wurden in die besser gekleideteres Design dieser Studie aufgenommen und verwendet, um diagnostische Sensitivität und Spezifität in Silico8 bewerten .
Aufgrund der Genauigkeit der Methode, seine Geschwindigkeit (< 1 h) und der Einfachheit des Protokolls, der Test hat gezeigt, dass geeignet für vor-Ort-Anwendung, wenn als Teil der Prozedur der Import in einem Schweizer POE8implementiert werden.
Die Möglichkeit, genau erkennen potenziell schädliche Organismen ohne zeitliche Verzögerung stellt einen wichtigen Aspekt für die Verwaltung der Schädling Arten9,10,26. Abgesehen davon, dass schnelle, für die Pflanze Importprodukte, sollte eine ideale Pest Identifikation Methode einfach vor Ort bei POEs8,26durchzuführen. Dieses Papier berichtet das Protokoll eines neuartigen Lampe-Assays für die schnelle Identifizierung von B. Tabaci, ein Insekt Quarantäneorganismus häufig an den europäischen Grenzen (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt abgefangen _annual-Bericht-_2016.pdf).
Die Beweggründe für die Entwicklung des diagnostischen Tests war es, eine easy-to-Follow-Protokoll zu entwerfen, die während der Prozedur der Pflanze Import von Pflanzen Gesundheitsinspektoren mit minimal Labor Ausbildung durchgeführt werden kann. Um vor-Ort-Tests als schnell und einfach wie möglich zu machen, ist das Protokoll, die Vorbereitung eines Ready-to-Use-Kit und die tatsächliche Leistung der Lampe Assay zweigeteilt. Der erste Teil kann in einem externen Labor durchgeführt werden, so dass die Pflanze Gesundheitsinspektor DNA-Extraktion und Lampe Assay mit nur einem Pipettieren Schritt vor Ort durchführen kann.
Aber können nur ein Schritt, Pipettieren kleinere Flüssigkeitsmengen Herausforderung für Anwender mit wenig oder gar keine Laborerfahrung sein. Um dieses Problem zu beheben, wird ein Farbstoff (Cresol rot) die Extraktionslösung hinzugefügt, so dass der Bediener visuell bestätigen kann, dass die kleine Menge (d. h. 2,5 µL) der DNA mit dem jeweiligen Rohr richtig übertragen wird. Eine weitere wichtige Vereinfachung des Protokolls ist die Validierung-Anwendung, wie es eine verlässliche Interpretation der Lampe auslesen (ergänzende Datei 1) erleichtert.
Roman B. Tabaci Lampe Assay ist unter Labor- und vor-Ort-Bedingungen validiert worden, durch die Prüfung Insekt Proben während den regulären Import Regelvorgang der Schweiz8abgefangen. Insgesamt wurden 80 Exemplare aus drei Kontinenten Afrika, Eurasien und Nordamerika, von Lampe analysiert. Die 80 Exemplare waren nur drei (3,8 %) falsch identifizierten (falsch-negative)8. Bei der Analyse der Primer-Ziel-DNA-Sequenzen der falsch-negativen Proben ergab, dass sie neue B. Tabaci Haplotypen waren, die bisher nicht beschriebene8gewesen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde B. Tabaci Lampe Grundierung Satz modifizierte und erfolgreich wieder validierten8.
Eine erhebliche Einschränkung der DNA Verstärkung-basierte Methode einschließlich Lampe ist, dass sie nur vordefiniertes Ziel DNA-Sequenzen8,27identifizieren. Ein umfassendes Wissen über die genetische Variation gefunden in der Zielsequenz Grundierung ist daher entscheidend für die diagnostische Genauigkeit8,27zu gewährleisten. Diese Informationen ist jedoch oft sehr begrenzt, insbesondere bei neu auftretenden Pest Arten8. Obwohl selten, sind falsch-Negative Ergebnisse verursacht durch Mutationen in der Zielsequenz erwarteten8. Im Falle der vorliegenden B. Tabaci Lampe Assay ist eine Lösung für dieses Problem die Kombination mit einer DNA-Barcoding-basierte Technologie, eine Strategie, die im Zuge der Umsetzung dieser diagnostischen Tests im POE Zürich Flughafen8realisiert. Hier wurden alle Lampe-Negative Ergebnisse von DNA-Barcoding in einem externen Labor8neu analysiert. Für den Fall, dass ein neuer Schädling Haplotyp noch nicht beschrieben angetroffen wird, können die Lampe-Primer mit der DNA-Sequenz erzeugt in dem Barcoding Prozess8geändert werden. Dabei wird der daraus resultierende Verlust der Geschwindigkeit im Falle eines negativen Ergebnisses der Lampe für die maximale diagnostische Genauigkeit gewährleistet in diesem zweistufigen Verfahren8kompensiert.
Die Einrichtungskosten für die aktuelle Lampe Assay an einem POE sind ca. USD 25.000. Mit der zunehmenden Zahl von Lampentests für Pflanzenschädlinge (z. B. Erwinia Amylovora, Flavescence Dorée und Guignardia Citricarpa) entwickelt, erscheint eine einmalige Investition gerechtfertigt13,15, 28. jedoch konnte das Protokoll möglicherweise geändert werden, um diese Kosten noch weiter zu reduzieren. Zum Beispiel könnte für die DNA-Extraktion Schritt bei 95 ° C Thermo-Mixer hier verwendet durch eine weniger teure Wasserbad oder von diesem Schritt direkt in die Echtzeit-Lampe-Gerät ersetzt werden. Darüber hinaus die Rührschüssel Schritte auf den Wirbel wahrscheinlich durch manuell flicking die Röhren ersetzt werden könnte, und in der DNA-Transfer Schritt könnte die Pipette durch sterile Impfösen ersetzt werden.
Zukünftige Verbesserungen für eine schnelle Identifizierung von B. Tabaci und Pest Spezies könnte im Allgemeinen eine Implementierung eines vor-Ort-Sequenzierung-Ansatzes, die DNA Barcoding Analysen an POEs erlauben würde. Ein vielversprechender Kandidat System für solche Implementierung ist die Nanopore-Sequenzierung-Technologie. In der Tat wurde die Technologie im vor-Ort-DNA Barcoding Bemühen um die Artenvielfalt ein Regenwald8,29,30bewerten vor kurzem erfolgreich umgesetzt. Ein vor-Ort-DNA-Barcoding-Identifikationssystem kann vollständig ersetzen, die Notwendigkeit für die Entwicklung von zielgerichteten diagnostischen Tests und deren Validierung. Auch ermöglicht es, zusätzliche Informationen über Pest Eigenschaften wie Pestizid-Resistenz-Gene8sammeln. Dennoch bis neuartiger Sequenziertechnologien routinemäßig umgesetzt werden, B. Tabaci Lampe Assay stellt eine schnelle (< 1 h) und genaue Identifizierung Methode.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren sind dankbar, dass Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun und Sven Moeller für die Teilnahme an der Validierung des B. Tabaci Lampe Assays.
B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |