Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

Todos los experimentos con animales se realizaron bajo los auspicios de la ley de animales (procedimientos científicos) de 1986 y en Reino Unido Comité de coordinación para las pautas de la investigación del cáncer. Todos los estudios en animales fueron realizados en el Instituto de Manchester de CRUK y aprobados por el bienestar de los animales local y ética revisar cuerpo (CRUK MI AWERB). 1. preparaciones Maxiprep pMP71 retroviral construcción de plásmidos y pCL-Eco retrovirus empaquetado plásmidos18.Nota: pMP71 codifica mCherry y el coche separados por una secuencia de FMDV2A. Esto es intercambiable con otras construcciones retrovirales. pCL-Eco codifica gag, pol y las proteínas de envoltura ecotropic. Preparar medio de células T completo (TCM) para el cultivo de células de ratón T con Medio RPMI 1640, 10% FCS, 1% 100 x penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG).Nota: La solución contiene 100 UI/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina), 50 μM β-mercaptoetanol y ácido-(2-hydroxyethyl)-1–1-ácido de 25 mM 4 (HEPES). La cultura A20 células en RPMI 1640, 10% FCS y 0,05 mM β-mercaptoetanol a 37 ° C, 5% CO2. Cultura de las células de platino-E (Plat-E) en medio de eagle modificado completa de Dulbecco (DMEM) (DMEM con suero de ternera fetal 10% (FCS), 2 mM L-glutamina, 1 puromicina μg/mL y 10 μg/mL blasticidin) a 37 ° C, 5% CO2.Nota: PLAT-E las células derivan de células 293T y expresan proteínas retrovirales de gag, pol y ecotropic envolvente. Preparar la transfección soluciones 1 y 2 inmediatamente antes de la transfección. Preparar la solución 1 (pH 7.9) contienen DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES, solución 2 (pH 7.1) que contenga DMEM + 25 mM HEPES. Preparar solución de fragmento de fibronectina humana recombinante de 10 μg/mL por dilución con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y almacenar a-20 ° C hasta su uso. Estéril filtrar todos los medios a través de 0,2 μm filtros antes de su uso (excluyendo fragmento de fibronectina humana recombinante). 2. retroviral transducción de células T Día 1: Preparación para transfección Semilla 7,5 x 106 platino-E (Plat-E) células en platos de cultivo de tejidos2 de 15 cm en 18 mL de DMEM completo e incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO2. Día 2: Transfección de Plat-E empaquetado retroviral de células Preparar 20,4 μg de pcl-Eco vector packaging ADN, 39,6 μg de DNA plasmídico codificación retroviral coche construir y 150 μL de 1 M de CaCl2 a volumen final de 3 mL de solución de la transfección 2 por plato de 15 cm2 al ser transfectadas. Vortex de 10 s y reposo por 5 min. Retire los medios DMEM de los platos de 15 cm2 y reemplace con 12 mL de solución de transfección 1.PRECAUCIÓN Al cambiar los medios de comunicación, pueden secar los platos de 15 cm2 en el centro. Esto puede causar la muerte sustancial de células transfected Plat-E. Trabajar rápidamente y retire los medios de comunicación de sólo 1-2 placas a la vez. Añadir 3 mL de solución de transfección 2 que contiene ADN y CaCl2 en cada plato2 de 15 cm mediante goteo, uniformemente a través de cada placa. Placas de la roca suavemente con un movimiento de lado a lado para 10 s. incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante la noche. Día 3: Preparación de que contiene virus de sobrenadante para la transducción Reemplazar los medios de comunicación de las células de la placa E transfected con 18 mL TCM de completar y devolución a la incubadora.PRECAUCIÓN Cuándo cambiar los platos de2 medios 15 cm puede secar en el centro. Esto puede causar la muerte sustancial de células transfected Plat-E. Trabajar rápidamente y retire los medios de comunicación de sólo 1-2 placas a la vez. Día 3: Aislamiento y en vitro de la activación de las células T del bazo de ratón Retire los bazos de ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad como se describió anteriormente por Parkinson et al. 19 y sumergirlos en estéril, helada, PBS en un tubo cónico de 50 mL. Utilice unas pinzas para transferir un bazo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y homogeneizar con un mortero de fuerza mínima. Utilice una pipeta de 1000 μL y ~ 800 μL PBS para transferir homogeneizado a un colador de célula de poro 100 μm colocado en un tubo de 50 mL que contiene 5 mL de PBS para lograr una suspensión unicelular. Repita el paso 2.4.2 para los bazos adicionales. No exceda 3 bazos por tubo.PRECAUCIÓN Esplenocitos pasado por filtro pueden formar grumos si deja de pie. Manualmente agitar tubos intermitentemente si procesar varios bazos para evitar la aglutinación de la célula. Quedan fragmentos en el colador de la célula puede ser más puré utilizando un émbolo de una jeringa de 5 mL con fuerza mínima. Superior a 20 mL con PBS. La suspensión de células de 20 mL en 20 mL de medio de gradiente de densidad (Tabla de materiales) en un tubo de 50 mL de la capa. Centrifugue la suspensión resultante superpuesta a 800 x g durante 20 min con ningún freno aplicado. Cosecha de las células en la capa de interfaz utilizando una pipeta Pasteur estéril y transfiéralo a un tubo de 50 mL. Superior a 50 mL con PBS y centrifugue a 800 x g por 10 min para lavar. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en TCM completa. Contar el número de células usando un hemocitómetro. Cultivo de células con una densidad de 5 x 106 células/mL en TCM completa con 30 ng/mL de anticuerpo anti-CD3ε (clon 2 145 C 11), 30 ng/mL de anticuerpo anti-CD28 (clon 37.51), 100 U/mL recombinante humano IL-2 y recombinante de 2 ng/mL murino IL-7. Utilizar un frasco de cultivo de tejidos de tamaño adecuado para el volumen de las células cosechadas.Nota: Que presenta células de antígeno–se requieren para la activación de células T por anticuerpos CD3 y CD28, si trabajando con linfocitos T purificados es necesario placas de capa con los anticuerpos, o utilizan granos magnéticos (Tabla de materiales) Incubar los esplenocitos de ratón a 37 ° C, 5% CO2 durante la noche. Día 3: Preparación de placas para la transducción Fragmentan de capa placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos no con 2 mL de fibronectina humana recombinante de 10 μg/mL e incuban durante una noche a 4 ° C. Día 4: Transducción de células de ratón T Transferencia fibronectina humana recombinante fragmento de placas cubiertas fresco cultivo de tejidos no bien 6 placas. Incubar las placas durante la noche a 4 ° C para la Ronda 2 de transducción de señales. Añadir 2 mL de TCM en cada pocillo de las placas originales de fragmento-revestidas de fibronectina humana recombinante y deja durante 30 min a temperatura ambiente para bloquear la fijación no específica. Coseche el sobrenadante que contiene el retrovirus de células transfected Plat-E en platos de cultivo de tejidos de 15 cm y volver a colocar con 18 mL de TCM completa.PRECAUCIÓN Trabajar rápidamente para evitar la desecación de las células E Plat.Nota: Éxito de la transfección puede comprobarse en esta fase por microscopía de fluorescencia si utilizando un gen marcador fluorescente como mCherry (figura 1). Filtrar el sobrenadante que contiene el retrovirus a través de 0,45 μm filtro para eliminar restos celulares. Eliminar TCM fibronectina humana recombinante fragmento recubierto con placas 6-bien y añadir 2,5 mL de sobrenadante filtrado de retrovirus que contienen o a cada pocillo (uso completo TCM para transfección falsa). Etiqueta cada uno así como la adición de retrovirus o media falsa. Centrifugue las placas a 1200 x g durante 30 min a temperatura ambiente. Mientras que las placas están girando, recoger las células de T activadas y contar usando un hemocitómetro. Transducción de señales se lleva a cabo con 5 x 106 activado esplenocitos en un total de 5 mL/pozo. De pellets la cantidad necesaria de esplenocitos de mock/transducción en tubos separados por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. Resuspender los esplenocitos en una densidad de 5 x 106 células por 2,5 mL de sobrenadante filtrado de retrovirus que contiene de paso 2.6.4 o TCM como control negativo. Añadir recombinante humano Il de-para las 2 (hIL-2) y ratón recombinante de IL-7 (mIL-7) a una concentración final de 200 UI/mL y 4 ng/mL respectivamente. Recoger las placas de 6 pozos de la centrifugadora en la terminación del paso 2.6.5 y añadir 2,5 mL/pocillo suspende de nuevo esplenocitos en pocillos adecuados para hacer un volumen final de 5 mL/pozo y una concentración final de 100 U/mL hIL-2 y 2 ng/mL mIL-7. Centrifugue las placas a 1200 x g durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, incubar las placas a 37 ° C, 5% CO2 durante la noche. Día 5: Ronda 2 de transducción de señales Recoger el fragmento de la fibronectina humana recombinante de las placas como esto puede ser usado de nuevo. Repita los pasos 2.6.2 – 2.6.5. Mientras que las placas están girando, recoger las células de la 1st redondo de transducción mediante una pipeta Pasteur. Lave cada pocillo con 2 mL de PBS, Remolino y recoger cualquier célula remanente en cada pozo.Nota: Pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células sedimentadas. Recoger cada grupo control/transducción en tubos separados. Tubos de centrífuga a 500 x g durante 5 min Resuspenda las células en 2,5 mL por pozo de transducción con 200 UI/mL IL-2 y 4 ng/mL IL-7. Repita los pasos 2.6.7 – 2.6.8. Extraer células de la centrifugadora e incubar a 37 ° C, 5% CO2 para las celdas de 4 h. recoger transduced en pasos 2.7.2-2.7.3. Contar las células, centrifugar a 500 x g durante 5 min y vuelva a suspender en TCM completa a una densidad de 1 x 106 células/mL, 100 U/mL hIL-2 y 2ng/mL 7 mIL. Transferir a un matraz de cultivo convenientemente tamaño e incubar a 37 ° C, 5% CO2. Añadir nueva TCM los medios de comunicación que contiene 100U/mL hIL-2 y 2ng/mL 7 mIL cada 2 días, manteniendo una densidad celular de 1 x 106 células/mL.Nota: Esplenocitos cosechados contienen una variedad de tipos celulares. Bajo estas condiciones de cultivo, las células T no mueren en el transcurso de 2-3 días. Después de ~ 4 días en cultivo celular, el número de células T es normalmente equivalente a la cantidad total de esplenocitos cosechados en el día 0. 3. medición de la eficiencia de la transducción de señales El día 4 post de transducción, recoge una muestra de las células de T de transduced o no-transduced (aproximadamente 3 x 105 células). Centrifugue la suspensión de células a 500 x g durante 5 min, eliminar el sobrenadante, lave las células concentradas una vez con PBS y centrifugar nuevamente. Deseche el sobrenadante y añadir 100 μL de PBS con un tinte reactivo conveniente amina (por ejemplo, manchas de vivo/muerto, dilución 1 en 100) por pozo. Incubar por 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Lavar dos veces con PBS, centrifugar a 500 x g por 5 min, descartar el sobrenadante e incubar con 50 μL de tampón FACS que contiene anticuerpos de anti-ratón CD16/CD32 para el receptor de Fc bloqueo (dilución 1 en 100). Incubar 10 min a 4 ° C. Directamente añadir 50 μL de anticuerpo manchas master mix que contiene anti-mouse BV786 CD4 y CD8 BV711 anticuerpos (concentración final de 1 μL/pozo en tampón FACS). Incubar durante 30 min a 4 ° C en oscuridad. Repetir el lavado 3.3. Resuspenda las células en tampón de PFA 1% y mantener el en la oscuridad a 4 ° C hasta su análisis por citometría de flujo. Analizar las células con citómetro adecuado equivalente usando la fluorescencia BV711, BV785 y mCherry como marcadores de subconjunto de linfocitos CD4 y CD8 y auto expresión gating respectivamente (figura 2). 4. in vitro validación de coche T cell actividad Semilla syngeneic destino CD19+ las células del tumor con o sin expresión de la luciferasa a una densidad de 1 x 104 células en 100 μL de TCM/pozo en un fondo de U 96 pocillos placa de cultivo de tejidos. Añadir 1 x 104 células/pocillo de CD19 coche T en un volumen de 100 μL/pozo para lograr una unidad de efectos relación objetivo (e: t) de 1:1.Nota: E: t ratios deberían establecerse para cada coche construir y línea celular de destino. Uso T células solas y solos como controles negativos de las células tumorales y las células T estimuladas por acetato de forbol miristato (PMA) (50 ng/mL) y ionomycin (1 μg/mL) como control positivo para la liberación de interferón gamma (IFNγ). Co de la cultura las células a 37 ° C, 5% CO2 para 16-24 h. Después de co-cultivo, Centrifugue las placas a 500 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante para su posterior análisis IFNγ y la IL – 12 p 70 ELISA.Nota: Esto puede ser almacenado a-80 ° C. Vuelva a suspender los pellets de células en 100 μL de PBS con luciferin (concentración final de 1,5 mg/mL). Incubar las placas durante 10 min a 37 ° C. Luego medir la luminiscencia de cada pozo con un luminómetro adecuado.Nota: Tiempos de exposición deben optimizarse para densidad y líneas celulares. Resultados representativos se muestran en la figura 3a. Citotoxicidad de ex vivo de células T auto puede modificarse a luciferin expresa por co-cultivo con líneas celulares que expresan el antígeno Diana. Como las células de T automóvil matan células diana, luciferin es liberado, por lo tanto una reducción en la señal luminometry se correlaciona con la muerte celular. Células no-transduced a menudo pueden tener un efecto sobre la viabilidad de las células blanco, particularmente sobre períodos de incubación. Medir la concentración de murino IFNγ y la IL – 12p 70 en el sobrenadante según protocolos de ELISA del fabricante. Resultados representativos se muestran en la (figura 3b y 3C). Activación ex vivo coche de células de T por co-cultivo con líneas celulares que expresan el antígeno objetivo puede ensayarse mediante el análisis de contenido de sobrenadante mediante ELISA. La relación de coche T cell a las células diana y duración del período de la cultura deben ser optimizados para cada coche construcción línea de célula blanco y analito. PMA y ionomycin tratamiento puede utilizarse como control positivo para confirmar la calidad de las células T y su capacidad de respuesta. 5. evaluar la actividad de lucha contra el cáncer en ratones Protocolo n ° 1 Realizar 100 mg/kg intravenoso (IV) entrega ciclofosfamida en ratones BALB/c de 6 a 8 semanas. Esto permite el engraftment tumor sin significativa lymphodepletion17 (figura 4).Nota: Establecer A20 linfoma puede tomar más de 2 meses con una tasa de tomar subóptima. Esto puede mejorarse mediante el uso de ciclofosfamida 1 día antes de la entrega de las células del linfoma. Para estudiar lymphoreplete ratones, identificamos una dosis de la ciclofosfamida que puede aumentar la eficiencia de linfoma sin causar lymphodepletion. Al día siguiente, inyectar 100 μl de 5 x 105 syngeneic A20 de células B linfoma células modificadas para expresar la proteína fluorescente verde y luciferasa (GFP) en ratones por la inyección intravenosa (IV). Permitir que los ratones a desarrollar linfoma sistémico para ~ 17 días. Inyección intraperitoneal (IP) de 100 μL de luciferin 30 mg/mL y la proyección de imagen usando una bioluminiscencia en vivo sistema de imagen para confirmar la presencia de linfoma sistémico. Utilizar separadores para evitar el desbordamiento de la señal en ratones adyacentes. Exponer ratones durante 1 min en el lado ventral con una región de tamaño constante de interés. Unidades relativas de luz (RLU) se muestran como fotones por segundo (p/s). Configuración debe optimizarse para cada modelo de tumor; Utilice una exposición que puede recoger con la detección temprana de tumores, pero no conduce a la saturación como tumores llegar a extremos. Registro RLU total para cada ratón con una constante tamaño de región de interés. (Figura 5a y b). Inyectar un linfoma de dosis única de 1 x 106 células de T automóvil por inyección IV en ratones lymphoreplete establecido.Nota: (importante) Niveles de dosificación debe ser establecida para cada coche construir usando un horario de escalada de dosis para asegurar que cualquier posible toxicidad derivados de las células de T automóvil se caracteriza y puede abordarse. Aunque células de anti-ratón CD19 coche T no muestran efectos tóxicos, las células de T del coche pueden dar lugar a toxicidades inesperadas. Donde no está idéntico múltiples coches construcciones y eficiencia de la transducción de señales, el número total de células T administrada debe tener igual por la adición de células T no-transduced en preparaciones celulares. Seguimiento de la progresión de la enfermedad semanalmente a través de la inyección del IP de 100 μL de luciferin 30 mg/mL y la proyección de imagen usando una bioluminiscencia en vivo imágenes de sistema (figura 5C). Estrechamente controlar ratones para detectar signos de toxicidad y eutanasia cualquier ratones que muestran signos tempranos de parálisis de extremidades (HLP) o carga tumoral patológico antes de que cualquier sufrimiento puede surgir.Nota: Toxicidad de linfoma A20 puede incluir parálisis de extremidades a través de la invasión del tumor de las meninges. Compruebe regularmente los signos tempranos de marcha alterada. Asimismo, pueden surgir tumores grandes de IP que puede conducir a molestias por conducta alterada. Seguimiento de la supervivencia de los ratones de 60-100 días (Figura 5D). Realizar la eutanasia por un método de programación-1 al término del experimento. Protocolo 2 Entregar ciclofosfamida de 200 mg/kg a 6 a 8 semanas de edad ratones BALB/c por cola inyección en la vena en 100 μL de PBS por ratón. Al día siguiente, inyectar de 5 x 105 syngeneic A20 células B células del linfoma expresan luciferasa y GFP en 100 μL PBS mediante cola inyección en la vena. Permitir que los ratones a desarrollar linfomas sistémicos de ~ 7-14 días Inyección del IP de 100 μL de luciferin 30 mg/mL y la proyección de imagen usando una bioluminiscencia en vivo sistema de imagen para confirmar linfoma sistémico. Realizar 5 Gy irradiación de cuerpo entero (TBI) a 0,02 Gy/min para lymphodepletion.Nota: Pacientes sometidos a tratamientos de coche T-cell se someten a una variedad de regímenes para lograr lymphodepletion antes de la administración de células T de coche que aumenta significativamente el engraftment de eventualmente las células de T del coche. Esto puede ser replicado en ratones con irradiación corporal total (TBI) (figura 6). Al día siguiente, inyecte 1 x 106 células de T del coche en 100 μL de PBS a través de cola vena inyección en ratones estableció los tumores. Recoger hemorragias de sangre las muestras via cola vena después de 7 días. Añadir el tampón de lisis de eritrocitos a cada muestra de sangre, y luego prepararse para citometría de flujo como se describe en la sección 3. Analizar la persistencia de células T del coche en la circulación mediante citometría de flujo (figura 2).Nota: Además de contar cuentas inmediatamente antes de la citometría permite determinación del número de células de T automóvil por mililitro de sangre. Monitorear el progreso de la enfermedad como se describe en pasos 5.1.5 – 5.1.8 (figura 7).