Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder auspiciën van de dieren (wetenschappelijke Procedures) Act 1986 en onder UK Coordinating Committee voor kankeronderzoek richtsnoeren. Alle dierlijke studies werden uitgevoerd bij de CRUK-Manchester institute en goedgekeurd door de lokale dierenwelzijn en ethiek Bekijk lichaam (CRUK-MI AWERB). 1. voorbereiding Maxiprep pMP71 retrovirale construeren plasmide en pCL-Eco retrovirus verpakking plasmiden18.Opmerking: pMP71 mCherry en de auto gescheiden door een FMDV2A-sequentie codeert. Dit is uitwisselbaar met andere retrovirale constructies. pCL-Eco codeert gag, pol en de ecotropic envelop eiwitten. Voorbereiden op volledige T cel medium (TCM) kweken muis T cellen met behulp van RPMI 1640 medium, 10% FCS, 1% 100 x penicilline-streptomycine-glutamine (PSG).Opmerking: De oplossing bevat 100 IU/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 2 mM van L-glutamine), 50 μM β-mercaptoethanol en 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES). Cultuur A20 cellen in RPMI 1640, 10% FCS en 0.05 mM β-mercaptoethanol bij 37 ° C, 5% CO2. Cultuur van de Platinum-E (Plat-E) cellen in volledige Dulbecco van gemodificeerde eagle medium (DMEM) (DMEM met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine, 1 μg/mL puromycin en 10 μg/mL blasticidin) bij 37 ° C, 5% CO2.Opmerking: Plat-E cellen zijn afgeleid van 293T cellen en express gag, pol en ecotropic envelop retrovirale eiwitten. Bereiden transfectie mediaoplossingen 1en 2 onmiddellijk voorafgaand aan de transfectie. Oplossing 1 (pH 7,9) bevatten DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES, oplossing 2 (pH 7.1) bevatten DMEM + 25 mM HEPES bereiden. 10 μg/mL recombinante menselijke fibronectine fragment oplossing bereid door verdunnen met steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaren bij-20 ° C tot gebruik. Steriel filter alle media door middel van 0,2 micrometer filters vóór gebruik (exclusief recombinante menselijke fibronectine fragment). 2. retrovirale transductie van T cellen Dag 1: Voorbereiding voor Transfectie Zaad 7,5 x 106 Platinum-E (Plat-E) cellen in 15 cm2 weefselkweek gerechten in 18 mL van volledige DMEM en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2. Dag 2: Transfectie van Plat-E retrovirale verpakkingslijn cel Bereiden 20.4 μg van pcl-Eco verpakking vector DNA, 39.6 μg plasmide DNA retrovirale auto construct en 150 μl van 1 M CaCl2 bij eindvolume van 3 mL transfectie oplossing 2 per 15 cm2 schotel-codering om te zijn transfected. Vortex voor 10 s en rest voor 5 min DMEM media uit de 15 cm2 gerechten verwijderen en vervangen door 12 mL van transfectie oplossing 1.Let op Bij het wijzigen van de media, kunnen de 15 cm2 gerechten drogen in het midden. Dit kan leiden tot aanzienlijke dood van transfected cellen van Plat-E. Werk snel en media van slechts 1-2 platen tegelijk verwijderen. Voeg 3 mL transfectie oplossing 2 met DNA en CaCl2 aan elk gerecht 15 cm2 drop-wise, gelijkmatig over elke plaat. Zachtjes rock platen met een beweging van links naar rechts voor 10 s. Incubate bij 37 ° C, 5% CO2 ‘s nachts. Dag 3: Bereiding van het virus-bevattende supernatant voor signaaltransductie Vervang de media van transfected cellen van de plaat-E met 18 mL TCM voltooien en terugkeren naar de couveuse.Let op Wanneer de media 15 cm2 gerechten wijzigen kan droog in het midden. Dit kan leiden tot aanzienlijke dood van transfected cellen van Plat-E. Werk snel en media van slechts 1-2 platen tegelijk verwijderen. Dag 3: Isolatie en in vitro activatie van muis milt T cellen Verwijderen van de milt van 6-8-week-oude BALB/c muizen zoals eerder beschreven door Parkinson et al. 19 en dompel ze in steriele, ijskoud, PBS in een conische tube van 50 mL. Gebruik pincet een milt overbrengen naar een microcentrifuge van 1,5 mL tube en meng met behulp van een stamper met minimale kracht. Gebruik een 1000 μL pipet en ~ 800 μL PBS homogenaat overbrengen naar een 100 μm porie cel zeef op een tube van 50 mL met 5 mL PBS voor de verwezenlijking van een interne celsuspensie aangebracht. Herhaal stap 2.4.2 voor de extra milt. 3 milt per buis niet overschrijden.Let op Splenocytes filter gepasseerd kan vormen bosjes als staande. Handmatig swirl buizen met tussenpozen als de verwerking van verschillende milt Voorkom cel samendoen. Resterende fragmenten op de zeef van de cel kan worden verder puree met behulp van een zuiger uit een 5 mL-spuit met minimale kracht. Top met PBS tot 20 mL. Laag de 20 mL celsuspensie zachtjes op 20 mL dichtheid kleurovergang media (Tabel van materialen) in een tube van 50 mL. Centrifugeer de resulterende overlay schorsing bij 800 x g gedurende 20 min met geen rem toegepast. Oogsten van cellen op interfacelaag met behulp van een steriele Pipet van Pasteur en overdracht aan een tube van 50 mL. Top tot 50 mL met PBS en centrifuge bij 800 x g gedurende 10 minuten om te wassen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in volledige TCM. Het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Cultuur van cellen bij een dichtheid van 5 x 106 cellen/mL in volledige TCM met 30 ng/mL anti-CD3ε antistof (kloon 145-2 C 11), 30 ng/mL anti-CD28 antilichaam (kloon 37.51), 100 U/mL recombinante menselijke IL-2 en 2 ng/mL recombinant lymfkliertest IL-7. Een gepaste afmetingen weefselkweek kolf gebruikt voor de hoeveelheid cellen geoogst.Opmerking: Antigeen-voorstellende cellen nodig zijn voor T-cel activatie door CD3 en CD28 antilichamen, indien werken met gezuiverde T cellen het noodzakelijk om jas platen met antilichamen is of gebruiken magnetische kralen (Tabel van materialen) Incubeer muis splenocytes bij 37 ° C, 5% CO2 ‘s nachts. Dag 3: Bereiding van platen voor signaaltransductie Vacht niet-weefsel-cultuur 6-Wells-platen met 2 mL 10 μg/mL recombinante menselijke fibronectine fragment en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Dag 4: Transductie van muis T cellen Transfer recombinante menselijke fibronectine fragment van gecoate platen naar verse niet-weefsel-cultuur 6-Wells-platen. Deze platen ‘s nachts bij 4 ° C voor ronde 2 van signaaltransductie uit te broeden. Voeg 2 mL TCM aan elk putje van de oorspronkelijke recombinante menselijke fibronectine fragment beklede platen en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te blokkeren van niet-specifieke binding. Retrovirus-bevattende supernatant van transfected cellen van de Plat-E 15 cm weefselkweek gerechten en vervangen met 18 mL voor volledige TCM oogsten.Let op Werk snel om te voorkomen dat drogen van Plat-E cellen.Opmerking: Succes van transfectie kan in dit stadium worden gecontroleerd door fluorescentie microscopie als met behulp van een fluorescerende marker-gen zoals mCherry (Figuur 1). Filtreer het supernatant retrovirus-bevattende door 0,45 micrometer filter verwijderen cel puin. TCM van recombinante menselijke fibronectine fragment beklede 6-Wells-platen verwijderen en toevoegen van 2.5 mL van het supernatans dat gefilterde retrovirus-bevattende of aan elk putje (gebruik compleet TCM voor mock transfectie). Label elk putje over de toevoeging van retrovirus of mock media. Centrifugeer de platen bij 1200 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Hoewel de platen zijn spinnen, verzamelen van geactiveerde T-cellen en tellen met behulp van een hemocytometer. Transductie is uitgevoerd met 5 x 106 geactiveerd splenocytes in een totaal van 5 mL/putje. Pellet het vereiste aantal splenocytes voor mock/signaaltransductie in afzonderlijke buizen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min. Resuspendeer splenocytes bij een dichtheid van 5 x 106 cellen per 2,5 mL van gefilterde retrovirus-bevattende supernatans uit stap 2.6.4 of TCM als negatieve controle. Recombinante menselijke IL-2 (hIL-2) en recombinant muis IL-7 (mIL-7) aan toevoegen een eindconcentratie van 200 IU/mL en 4 ng/mL respectievelijk. 6-Wells-platen van de centrifuge bij de voltooiing van stap 2.6.5 verzamelen en toevoegen van 2.5 mL per putje opnieuw gesuspendeerde splenocytes in passende wells maken een eindvolume van 5 mL / goed en een eindconcentratie van 100 U/mL hIL-2 en 2 ng/mL mIL-7. Centrifugeer de platen bij 1200 x g gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de platen bij 37 ° C, 5% CO2 ‘s nachts na het centrifugeren. Dag 5: Ronde 2 van signaaltransductie De recombinante menselijke fibronectine fragment van de platen verzamelen zoals dit hergebruikt worden kan. Herhaal stap 2.6.2 – 2.6.5. Terwijl platen zijn spinnen, de cellen van de 1st ronde van signaaltransductie met behulp van een precisiepipet Pasteur verzamelen. Spoel elk putje met 2 mL PBS, swirl en verzamelen alle resterende cellen in elk putje.Opmerking: Pipetteer omhoog en omlaag om resuspendeer gesedimenteerd cellen. Verzamelen van elke groep van de controle/signaaltransductie in afzonderlijke buizen. Centrifuge buizen bij 500 x g gedurende 5 min. resuspendeer cellen in 2.5 mL per putje van signaaltransductie met 200 IU/mL IL-2 en 4 ng/mL IL-7. Herhaal stap v2.6.7 – 2.6.8. Cellen verwijderen uit de centrifuge en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 4 h. verzamelen getransduceerde cellen zoals in stappen 2.7.2-2.7.3. Cellen tellen, centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min en resuspendeer in volledige TCM bij een dichtheid van 1 x 106 cellen/mL met 100 U/mL hIL-2 en 2ng/mL mIL-7. Breng in een maatkolf van voldoende grootte cultuur en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Voeg verse TCM media met 100U/mL hIL-2 en 2ng/mL mIL-7 om de 2 dagen, behoud van een celdichtheid van 1 x 106 cellen/mL.Opmerking: Geoogstvan splenocytes bevatten een aantal celtypes. Onder deze cultuuromstandigheden niet T cellen sterven af in de loop van 2-3 dagen. Na ~ 4 dagen in de cultuur van de cel, het aantal T-cel is meestal gelijk aan het totale aantal geoogste splenocytes op dag 0. 3. meting van de transductie efficiëntie Op dag 4 post signaaltransductie, verzamelen een steekproef van getransduceerde of niet-getransduceerde T-cellen (ongeveer 3 x 105 cellen). Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant, wassen de Ingehuld cellen een keer met PBS en Centrifugeer nogmaals. Verwijder het supernatant en voeg 100 μl van PBS met een geschikt amine reactieve kleurstof (bv, live/dode vlek, 1 op de 100 verdunning) per putje. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Spoel tweemaal met PBS en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en incubeer met 50 μl van FACS buffer met anti-muis CD16/CD32 antilichamen voor Fc receptor blokkeren (1 op de 100 verdunning). Incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Direct toevoegen 50 μl van antilichaam kleuring master mix met anti-muis CD4-BV786 en CD8-BV711 antilichamen (eindconcentratie van 1 μl per putje in FACS buffer). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. Herhaal de wassen stap 3.3. Resuspendeer de cellen in 1% PFA buffer en houden het in het donker bij 4 ° C tot analyse door stroom cytometry. Het analyseren van cellen met gelijkwaardige geschikte cytometer met behulp van BV711, BV785 en mCherry fluorescentie als markeringen van CD4 en CD8 subset en auto meningsuiting respectievelijk gating zoals in (Figuur 2). 4. in vitro validatie van auto T cel activiteit Zaad syngeneic target CD19+ tumorcellen met of zonder luciferase uitdrukking bij een dichtheid van 1 x 104 cellen in 100 μl TCM per putje in een 96-Wells U-bodem weefselkweek plaat. 1 x 104 CD19 auto T cellen per putje toevoegen in een volume van 100 μl per putje te bereiken een effector target (E:T) / ratio van 1:1.Opmerking: E:T ratio’s moeten worden vastgesteld voor elke auto construeren en cellijn richten. Gebruik T cellen alleen en tumorcellen alleen als negatieve controles en T cellen gestimuleerd door phorbol-myristaat-acetaat (PMA) (50 ng/mL) en ionomycin (1 μg/mL) als positieve controle voor Interferon gamma (IFNγ) versie. Co cultuur cellen bij 37 ° C, 5% CO2 voor 16-24 uur. Na co cultuur, centrifugeren van de platen bij 500 x g gedurende 5 min en verzamelen van het supernatant voor verdere analyse van IFNγ en IL – 12 p 70 ELISA.Opmerking: Dit kan worden achtergelaten bij-80 ° C. Resuspendeer cel pellets op in 100 μl van PBS met luciferine (eindconcentratie van 1,5 mg/mL). Incubeer de platen gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Meet vervolgens de luminescentie van elk putje met een geschikt luminometer.Opmerking: Belichtingstijden moeten worden geoptimaliseerd voor cellijnen en dichtheid. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 3a. Ex-vivo cytotoxiciteit van auto T cellen kan aan uitdrukkelijke luciferine door co cultuur met cellijnen uiten doel antigeen worden gewijzigd. Als auto T cellen doden doelcellen, luciferine is vrijgegeven, dus een vermindering van luminometry signaal is gecorreleerd met cel doden. Non-getransduceerde cellen kunnen vaak een effect hebben op de levensvatbaarheid van de cellen van de doelstelling, met name gedurende perioden van de lange incubatietijd. Het meten van de concentratie van lymfkliertest IFNγ en IL – 12p 70 in het supernatant volgens protocollen van de ELISA van de fabrikant. Representatieve resultaten staan in (Figuur 3b en 3 c). Ex-vivo activering van auto T cellen door co cultuur met cellijnen uiten doel antigeen kan worden bepaald door het analyseren van supernatant inhoud met behulp van ELISA. De verhouding van auto T cel naar de doelcellen en lengte van de periode van de co cultuur moeten worden geoptimaliseerd voor elke auto construct, doel cellijn en analyt. PMA en ionomycin behandeling kan als positieve controle worden gebruikt ter bevestiging van de kwaliteit van T-cellen en hun vermogen om te reageren. 5. beoordeling van de anti-kanker activiteit in muizen Protocol 1 Uitvoeren van 100 mg/kg intraveneuze (IV) levering van cyclophosphamide in 6 tot 8 weken durende BALB/c muizen. Hierdoor kan de tumor engraftment zonder significante lymphodepletion17 (Figuur 4).Opmerking: Tot oprichting van de A20 kun lymfoom je meer dan 2 maanden met een suboptimaal nemen koers. Dit kan worden verbeterd door het gebruik van cyclophosphamide 1 dag voorafgaand aan de levering van cellen van het lymfoom. Om te kunnen studeren lymphoreplete muizen, we geconstateerd dat een dosis van cyclophosphamide waardoor efficiëntie van lymfoom zonder lymphodepletion. De volgende dag, injecteren 100 µL van 5 x 105 syngeneic A20 B-cel lymfoom cellen aangepast express luciferase en groen fluorescente proteïne (GFP) muizen door intraveneuze (IV) injectie. Toestaan dat de muizen te ontwikkelen van systemische lymfoom voor ~ 17 dagen. De aanwezigheid van systemische lymfoom bevestigen door intraperitoneale injectie van (IP) van 100 μl van 30 mg/mL luciferine en beeldvorming met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem. Scheidingstekens gebruiken om te voorkomen dat signaal spillover naar aangrenzende muizen. Bloot muizen voor 1 min aan de ventrale zijde met een constante formaat regio van belang. Relatieve licht eenheden (RLU) als de fotonen per seconde (p/s) weergegeven. Instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor elk model van de tumor; Gebruik een blootstelling die vroegtijdige opsporing van tumoren kan halen maar leidt niet tot verzadiging zoals tumoren eindpunten bereiken. Record totale RLU voor elke muis met een constante formaat regio van belang. (Figuur 5a en b). Het injecteren van een enkelvoudige dosis van 1 x 106 auto T cellen door IV injectie in lymphoreplete muizen die gevestigde lymfoom.Opmerking: (belangrijk) Dosering van niveaus moet worden vastgesteld voor elk auto bouwen met behulp van een dosis escalatie schema om ervoor te zorgen dat elke mogelijke toxicities die voortvloeien uit de auto T-cellen worden gekenmerkt en kunnen worden aangepakt. Hoewel anti-muis CD19 auto T-cellen toxicities niet wordt weergegeven, kan auto T cellen aanleiding kunnen geven tot onverwachte toxicities. Waar meerdere auto constructies en transductie efficiëntie niet identiek zijn, moet het totale aantal T-cellen toegediend worden bewaard gelijk door de toevoeging van niet-getransduceerde T-cellen in de voorbereidingen van de cel. Monitoren van de progressie van de ziekte wekelijks via IP-injectie van 100 μl van 30 mg/mL luciferine en beeldvorming met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem (Figuur 5 c). Monitoren van muizen op tekenen van toxiciteit en euthanaseren van alle muizen die vroege symptomen van hind-limb verlamming (HLP) of pathologische tumor last vertonen voordat elk lijden kan ontstaan.Opmerking: Toxicities van A20 lymfoom kunnen opnemen hind-limb verlamming door invasie van de tumor van de hersenvliezen. Controleer regelmatig op vroege tekenen van gewijzigde gait. Grote IP-tumoren kunnen ook ontstaan die kan leiden tot ongemak getoond door veranderde gedrag. Toezicht op overleving van muizen voor 60-100 dagen (Figuur 5 d). Euthanasie uitvoeren door de methode van een schema-1 na beëindiging van het experiment. Protocol 2 200 mg/kg cyclofosfamide aan 6 tot en met 8 – weken oude BALB/c muizen door staart veneuze injectie in 100 μl van PBS per muis leveren. De volgende dag, injecteren van 5 x 105 syngeneic A20 B-cel lymfoom cellen uiten luciferase en GFP in 100 μl PBS via staart veneuze injectie. Toestaan dat de muizen te ontwikkelen van systemische lymfomen voor ~ 7-14 dagen Systemische lymfoom bevestigen door IP-injectie van 100 μl van 30 mg/mL luciferine en beeldvorming met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem. 5 Gy totale lichaam bestraling (TBI) bij 0,02 Gy/min voor lymphodepletion uitvoeren.Opmerking: Patiënten die een auto T-cel-behandelingen ondergaan tal van regimes te bereiken lymphodepletion voordat de administratie van auto T cellen die aanzienlijk verhoogt de engraftment van adoptively auto T-cellen overgedragen. Dit kan worden gerepliceerd in muizen met totale lichaam bestraling (TBI) (Figuur 6). Injecteren op de volgende dag, 1 x 106 auto T-cellen in 100 μl van PBS via staart veneuze injectie in muizen die gevestigde tumoren. Het verzamelen van bloed monsters via staart ader afloop na 7 dagen. Rode cellysis-buffermengsel toevoegen aan elke bloedmonster, dan stroom cytometry voorbereiden zoals beschreven in sectie 3. Het analyseren van auto T cel persistentie in de omloop door stroom cytometry (Figuur 2).Opmerking: Toevoeging van tellen kralen vóór cytometry kunt bepalen van het aantal auto-T cellen per milliliter bloed. Voortgang ziekte zoals beschreven in stappen 5.1.5 – 5.1.8 (Figuur 7).