無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

任意の化学物質を使用する前にお読みください注意: すべての関連化学物質安全性データ シート (MSDS)、すべての適切な安全の実践などを観察し、必要に応じて個人用保護具 (レーザー安全メガネ、眼用保護具、手袋、実験室のコート) を着る。 1. 建物 iSCAT 顕微鏡16,18 注: iSCAT 顕微鏡は通常変更された倒立顕微鏡のセットアップので構成されます。簡単に言うと、レーザーは高開口数 (NA) 目的の後焦点面に焦点を当てて、結像レンズがカメラ チップの上に粒子の後方散乱光を集中する使用されます。一般に、この広視野顕微鏡をゼロから構築または既存の倒立顕微鏡に基づくできます。このプロトコルは、使用されるハードウェアの変更が可能なセットアップを実現するために不可欠な手順をカバーしています。ISCAT 顕微鏡のアセンブリのより詳細な説明は、アロヨらの仕事で見つけることができます。18。 注意: iSCAT 顕微鏡にはクラス IV レーザー光源にクラス IIIB が含まれます。適切な眼の保護は組立、顕微鏡光学系を調整するときに必要です。顕微鏡組立時にレーザービームの経路がストレートのまま、新たな光学部品を追加するとに偏向がないことを確認します。 顕微鏡の照明のパスを設定します。 高開口数 (NA) 目的を組み込んだ顕微鏡サンプル ステージ18減衰光学テーブル、堅い金属のブロックを使用して構築 (100 X 1.46/NA) とフォーカスの変更と同様、水平サンプル翻訳では、翻訳単位目的の位置。メモ: 単一蛋白質を検出の限界で iSCAT 顕微鏡の操作は外部振動に非常に敏感です。すべての側面からサンプルをサポートする同心円ピエゾ ステージ焦点と横方向の安定性を危険にさらすそれ以外のサンプルの音響振動を制限する勧めします。図 1は、ピエゾの翻訳単位および目的など適切なサンプル ステージを示しています。さらに、次の手順で説明したすべての光学部品用大規模かつ安定したマウントを使用することをお勧めします。このようなコンポーネントは、商用光学サプライヤーから入手。 50 cm 焦点距離一重項レンズ (広視野レンズ) と 45 ° (垂直) 対物レンズの後焦点面に波長 445 nm ダイオード レーザーの光を集中するミラーを結合を使用します。これは目的のフォーカス前方に平行光を作成し、iSCAT 光源になります。必要な場合は、30 μ m のピンホールまたはシングル モード光ファイバー経由で 50 cm のレンズの前に空間的レーザーをフィルターします。 目的にイマージョン オイルの滴を適用し、顕微鏡ステージのサンプル面にガラス基板を配置します。これはイメージングの目的を途中で反射ビームになります。注: 反射サンプル coverslip の上面の空気ガラス インターフェイスから発生し、iSCAT 参照光のための基礎となります。残留汚れやほこりが、カバーガラスの表面散乱ポイント ソースは、次の手順で画像の目的の正しい焦点の援助に上昇を与えます。注意: レーザー光の大半、coverslip を介して送信、目的からまっすぐに移動します。不透明なスペキュラ ディフューザーを配置 (e.g。、紙カード) レーザー光による損傷のリスクを最小限に抑える coverslip の上。 図 1: iSCAT サンプル ステージ。写真中心の 100 と同様にマウントされているピエゾ翻訳単位 (ブラック) 大規模なアルミ ブロックを示しています x の目的。3 軸ピエゾ ステージの目的の焦点面のサンプルの正確な位置決めが可能です。粗い焦点は (描かれていない) 目的がマウントされているスレッド チューブを回転させることにより行われます。ブロックは、45 ° 鏡の上 4 つの鋼台座と光学テーブルに配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 顕微鏡のイメージのパスを設定します。 反射防止 (AR) をご紹介-広視野レンズの後, 入射と約 10 cm を基準にして 45 ° の角度でビームスプリッター (反射 70%、30% の伝送) をコーティングします。AR コーティングをレーザー光源に向いてください。これは、入射ビームを送信して参照を反映し、入射ビームに対して 90 ° の角度でビームの散乱します。注: ゴーストとフリンジの影響は、ビーム分割キューブ、またはコーティングされていない平面ビームスプリッターを使用する場合に発生する可能性が、AR コーティングおよび/またはくさびビームスプリッターお勧めします。詳細については、ディスカッションを参照してください。必要な場合、ビームスプリッターの後ろ側から生じるあらゆる不要な反射光は虹彩絞りを使用してブロック可能性があります。 厚いビームスプリッターは、レーザーは、目的をまっすぐにもう入ることもありませんので、大きな梁の変位をご紹介いたします。必要な場合は、目的を正しく伝達されるようにビームスプリッター前にレーザービームの経路を再編成します。メモ: ワイド フィールド レンズの前にビームスプリッターを追加も可能性があり、顕微鏡ステージ配置されます (ステップ 1.1.2) で、ビームは後で変位しないように。 この時点で干渉計のイメージングの腕に焦点を当てるし、試料面とカメラが同焦点であることを確認します。凹 f の場所 = 入射パスで広視野レンズ後の位置 5 cm-45 cm レンズ。これは目的の背面の開口部に入る平行光になります。 干渉計の反射のアームに配置画面で、粗い焦点位置を見つけると垂直方向の目的を移動します。目的は、画面にあたる光を平行光にフォーカスです。注:図 2は、このプロセスの概略を示します。 両方 f を削除 =-45 cm レンズと画面中心に粗が完了。注: 負の焦点距離のレンズを使用する代わりに広視野レンズ自体に可動式マウント上に配置し、このステップのビーム光路からシフト アウトします。ただし、最も安定した顕微鏡構成を成し遂げるためには、固定位置に広視野レンズを保持する勧めします。 2 番目の f を追加 = 50 cm 一重項レンズと CMOS カメラ センサーの上に反射した光をコリメートする散乱光を集中します。レンズが再参照光をコリメートし、散乱光を集中するために対物レンズの後焦点面から 50 cm を置かれることを確認します。 場所 CMOS チップ f から 50 cm 50 cm レンズを = し、チップの中央に直接ビームを配置。注: 次のパラメーターは、イメージングのため通常使用されます。レーザー (波長 445 nm) の出力電力は、100 に設定されて mW。ピンホールとビームスプリッター、目的を入力有効電力が約 9 に透過光を減衰させる mW。サンプル位置でのビーム径は、6 μ m になります。使用するイメージング レンズ システムの有効倍率は約 300 x です。CMOS チップ上のイメージのサイズは約 5 × 5 μ m2の視野の結果、照射領域内の 128 ピクセル 128 × に設定されます。図 3は、完全に組み立てられた iSCAT 顕微鏡の概略を示しています。 図 2: iSCAT 顕微鏡の粗中心します。回路図は、フォーカスにシステムをもたらすために光学系の配置を示しています。ビームスプリッターの AR コーティング裏面 (70/30 BS) 赤で示されます。グリーンは、重要な距離を提供しています。使用レンズの焦点距離 (f) が示されます。手順 1.2.6 – 1.2.7 青い破線のボックス内のコンポーネントが追加されました。凹レンズ (再集束 iSCAT 光をコリメートに使用) と画面は後で削除されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: iSCAT 顕微鏡。回路図は、完全に組み立てられた iSCAT 顕微鏡を示しています。ビームスプリッターの AR コーティング裏面 (70/30 BS) 赤で示されます。グリーンは、重要な距離を提供しています。使用レンズの焦点距離 (f) が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 画像の追加チャンネルを設定します。注: このセクションは、大周辺 iSCAT レーザー明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡による細胞生存率を監視するための観察ができる顕微鏡イメージングの別のパスを追加します。 カップルの LED 光源の出力 (約 500 nm < λ < 580 nm) に長い作業距離 20 X/0.4 NA 目的と焦点と LED 出力の横方向位置決めを可能にする上記のサンプル室機械コンポーネントをインストール、サンプルです。 LED のスペクトルは細胞死のマーカー (ヨウ化 propidium (PI)) の励起範囲をカバーし、その蛍光 (λ > 600 nm) と干渉しない出力することを確認します。必要な場合は、光学フィルターを使用します。 上の目的を横方向に移動上 (広域) と下部 (iSCAT) 目標は、共線性がようにします。これは、画面下の低い目標を配置して画面上の送信 LED 光源の強度を最大化することによって決定されます。配置、λ = 550 nm ショートパス ダイクロイック ミラー (アーム) 送信 LED iSCAT レーザーの経路からの光を分割します。 このビームを 8 %reflective/92% 透過ビーム分割 (BS) と 2 つのチャンネルに分割します。92% のパスは蛍光チャネル、8% パスは明視野イメージングに使用されます。 画像の f を使用して CMOS カメラに明るいフィールド チャネル 5 cm 色消しレンズを =。 画像の f を使用して別の CMOS カメラに蛍光チャネル 5 cm 色消しレンズと λ を = = 600 の nm ロングパス ・ フィルター励起光を遮断します。図 4 aは、すべての画像チャンネルを含む、完全に組み立てられた顕微鏡の概略を示しています。 図 4: 単一細胞から分泌されるタンパク質の iSCAT 顕微鏡。(a)プロトコルで説明されている顕微鏡の概略図。詳細については、セクション 1 を参照してください。略語: LED、発光ダイオード。SPF、ショートパス フィルター;obj、目的;アーム、ショートパス ダイクロイック ミラー;BS、ビームスプリッター。ロングパス ・ フィルター LPFBF、明るいフィールド;蛍光、蛍光。C1 C3、カメラ 1-3。単一の(b)明視野イメージ Laz388 細胞 (白い正方形が描かれている) のビュー フィールド iSCAT から約 4 μ m です。C3 は、カメラで撮影した画像スケール バー: 10 μ m (c)蛍光画像とセルの位置 (b) に示すように同じ地域の白い丸でマークします。蛍光性の不在は、実行可能なセルがあることを示します。C2、カメラで撮影した画像スケール バー: 10 μ m (d)生 iSCAT カメラ画像スナップショット 80 μ 秒の露光時間で。C1 のカメラで撮影した画像。時空間背景差分ディスカッション セクションの説明に従って後に同じ領域の(e) iSCAT イメージ。イメージは 1000 連続生フレーム (d) 最後のフレーム時間で 400 ms の上統合されていた、ガラス基板の表面粗さを明らかにします。(f)対応差分 iSCAT イメージです、coverslip の上に 2 つのタンパク質の結合イベントを示しています。画像は、2 つの連続したフィルターが適用されたイメージ (e) を減算することによって建設されました。(D) でバーを拡張 (e) 及び (f): 1 μ m。この図は、マクドナルド、m. p.らから適応されています。16. 著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 コンピューターとソフトウェアを設定します。 すべてのカメラをコンピューターに接続します。それぞれのドライバー パッケージをインストールおよびその制御のためのソフトウェアの取得/書き込み。注: 適切なハードウェアは高速買収に必要です。最低限、マルチコア プロセッサ、16 GB の RAM、フレームグラバとデータ ストレージのためのソリッドステート ディスクはお勧めします。 CMOS カメラで iSCAT 画像を観察し、ガラス基板上残留のほこりや汚れの粒子を見つけることによってフォーカスであることを確認します。粒子の画像回転対称の点広がり関数 (PSF) ことを確認します。注: 非円対称の PSF の主な理由は、レーザー光では、ストレートが光軸に対して小さい角度で目的は入らないです。これが 45 ° 鏡と入射ビームの位置や角度を調整することによって修正します。 明視野と蛍光チャンネルのカメラ画像を比較します。両方がフォーカスされていることを確認同じエリアを表示します。ISCAT レーザーの位置は画像の中心部約ことを確認し、後で参照のための位置のメモを取る。典型的なカメラ画像の図 4b-4 階を参照してください。注: は、2 つのチャネルの焦点を見つけるにセルのサンプルや蛍光ビーズを使用します。システムを調整する蛍光ロングパス ・ フィルターを一時的に削除します。セルの従来のイメージングのための焦点は iSCAT 焦点面よりわずかに高い必要があります。目的を移動せずに、これを補うため、それぞれ 2 つの f のフォーカスの位置からカメラを置き換えません = 5 cm レンズ。 必要なカメラのパラメーターを設定します。固定フレーム レートを使用し、ソフトウェアの利得や補正ツールを無効にします。注: 次のパラメーターを使用: iSCAT カメラは 80 μ 秒の露光時間で 5000 フレーム/秒 (fps) に設定されています。前述のように、イメージのサイズは 128 × 128 ピクセルです。明視野と蛍光カメラは、フルフレーム サイズ (1280 × 1024 ピクセル) で動作します。明視野イメージングは、20 ms の露光時間で行われます。蛍光カメラ 750 ms 露光時間に設定されて、5 連続したフレームは、1 つの最終的なイメージを形成する累積されます。明視野と蛍光画像は、固定の 20 秒ごとに取得されます。 2. 実験の準備 ストック顕微鏡媒体の準備。 HEPES 緩衝液 25 mL を追加 (1 mol/L) を 25 ミリ モル/L HEPES ソリューションの最終的な 1 L RPMI 1640 媒体の 975 mL。また、既に含まれている HEPES をバッファー媒体を使用します。注: HEPES が周囲条件 (例えばインキュベーター外と一定の CO2供給なし) で測定中に培地の pH 値を維持するために使用されます。 実験に必要なソリューションの因数を取る、それは室温まで温。媒体の 2 mL で十分です。4 ° C で残り原液を維持します。 顕微鏡キュベットを準備します。注: 次の手順は、アルミニウム ベース プレートと、coverslip の修正し、圧電 3 D ポジショナーにカップルの両方アクリル キュベット料理から成るカスタム サンプル ホルダーに手順をについて説明します。ガラス底の市販の無菌培養皿も使えます。注:図 5は、特注のサンプル ホルダーの写真を示しています。 新しい顕微鏡観察を取るし、脱イオン水 (純水) とエタノールそれをすすいでください。空気は窒素と加圧空気スライドを乾燥させます。 500 W の高周波電力で 10 分間の酸素プラズマ雰囲気 (0.3 mbar 圧力) の coverslip をきれい。これは表面からすべて有機不純物を取り除きます。 0.2 mol/L の DI 水で約 10 分リンスの NaOH 溶液に浸漬することによりアクリル キュベット皿をきれい。 試料ホルダーを組み立てる、プラスチック シャーレ実験で必要になるまででそれをカバーします。 図 5: 特注サンプル ホルダー 。(a)サンプル ホルダー コンポーネント: (1) アクリル キュベット皿;(2) アルミニウム ベース プレート;(3) 固定するネジ。(4) シリコン o リング;(5) coverslip。(b)試料ホルダーが完成。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 顕微鏡を準備します。 ISCAT 照明レーザー、明るいフィールド/蛍光照明 LED、カメラ、および取得のコンピューター/ソフトウェアをオンにします。目的の前に、の位置でレーザー ビームをブロックします。 100 X 確認/1.46 NA 目的はきれい。該当しない場合は、製造元のガイドラインに従って目的をきれいにするクリーニング ワイプおよびエタノールのレンズを使用します。 対物レンズに液浸オイルの滴を適用します。 (セクション 2.2 で組み立て) サンプル ホルダーを取るし、サンプル coverslip、対物レンズを中心に、慎重に iSCAT 顕微鏡のピエゾ ステージでそれをマウントします。気配りと対物レンズを損傷しないように注意します。メーカー指定の規定最大トルクを超えないことを確保しながら親指ネジで圧電ポジショナにユニットを固定します。 キュヴェットにストック顕微鏡媒体 (セクション 2.1 の準備) の 1 つの mL を追加します。 細胞死のマーカー16,22としてメディアに propidium ヨウ化染色の 2 滴を追加します。 レーザーのブロックを解除しにフォーカス システムをもたらします。まず、目的が 1.2.3 の手順を繰り返すことによって、coverslip から適切な距離で配置されていることを確認します。-1.2.5。(図 2)。その後、ピエゾ ステージの z 軸でフォーカスを微調整します。 光源、カメラ、およびソフトウェアのすべての設定が正しく設定されていることを確認します。これは、レーザー出力、LED 強度、カメラ フレーム レート、カメラの露出時間やパスを保存ソフトウェアなどのパラメーターが含まれています。注: ファイル サイズの大きいを作り出すことができる高フレーム レートで動画を保存します。コンピューターに十分な空きディスク領域ことを確認します。 再びレーザー ビームをブロックします。顕微鏡は、実験の準備が整いました。 セルを準備します。注: Laz388 セル20 10% 牛胎児血清 (FCS)、アミノ酸、ピルビン酸、および抗生物質添加 RPMI 1640 培地で培養しています。セルが分割し、提供新鮮な培地ですべての 2-3 日2337 ° C、5% CO2でいます。 細胞培養用フラスコをインキュベーターから取り出して約 1 x 10 の6セルを含む培地を吸引します。適切なボリュームを決定するには、診断法による培養細胞の濃度を定量化します。 携帯ソリューションを混ぜて室温で RPMI 1640 媒体の 10 mL とは 7 分間 300 x g でサンプルを遠心分離します。 慎重に抽出し、濃縮細胞のペレットの平静を保持しながら上澄みを廃棄します。 2.4.2 の手順を繰り返します。-2.4.3。細胞の集中ペレット。 再 0.5 mL 在庫顕微鏡媒体 (セクション 2.1 の準備) のセルを中断し、すぐに実験で使用します。 3. iSCAT 分泌細胞の顕微鏡観察 セルの iSCAT レーザー光に直接さらされることを防ぐためにレーザー光線がブロックされていることを確認します。 サンプル キュベットにセルを挿入します。 サンプル キュベットにセルのサンプル (の準備セクション 2.4) 少し中心の約 3 μ L を注入します。そっと触れる、coverslip のピペット チップ、細胞液をゆっくりと注入します。上、解決するためのセルを許可します。注: は、少量ピペット チップ (10 μ L) または長い、柔軟なゲルの読み込みヒントを使用します。 単一セル測定 iSCAT レーザー周辺の複数のセルに影響されないように、細胞密度 500 µm² あたり約 1 セルの下にあるを確認します。 細胞数は低すぎる、もう一度手順 3.2.1 だ場合まで十分な数は、利用可能なです。 細胞の適用範囲の密度が高すぎる場合、coverslip 細胞を分散させる追加顕微鏡の中の約 20 μ l 注入を使用します。 ピエゾ ポジショナを使用すると、すぐ (約 10 μ m) にセル iSCAT 視野の位置に横方向にサンプルに移動します。445 nm レーザー光を直接浴びるはセルの有害であるかもしれないとセルは iSCAT 視野に入らないことを確認します。 明視野/蛍光画像を使用して見つけ、細胞の生存率25を確認します。注: 実行可能なセル丸い形は、明視野像と細胞死、細胞22内 propidium ヨウ化の存在から生じる強い蛍光信号によって示されるに対し、蛍光ではないです。 ISCAT レーザー ビームをブロック解除し、coverslip 表面がフォーカスまだことを確認します。ドリフトや周囲の環境からの音響結合を最小限に抑える免震テーブルを囲みます。注: 後者は、重光カーテンまたは光学テーブルを囲むアクリル パネルします。 ISCAT、明視野と蛍光のカメラから画像を取得して、測定を開始します。自動化および実験効率を最大化するソフトウェアを通じてプロセスを制御します。細胞の生存率およびシステムの焦点を定期的にチェックします。注: レーザー強度、光学部品、カメラの露出時間の設定、に応じて iSCAT レーザー蛍光カメラと干渉する可能性があります。この現象が発生した場合は、iSCAT レーザーを蛍光画像集録中に一時的に閉鎖することを検討してください。 4. データ解析 注: 実験データは本質的にノイズの多い、iSCAT イメージは異なっています。入射光源、表面粗さの観察とカメラのノイズで波面歪みを含む典型的な iSCAT 測定におけるノイズのいくつかのソースがあります。以下のセクションでは、これらの騒音源が後処理によって改善がいくつかの方法を示します。また、セットアップの機械的不安定性横ノイズの多いデータを引き起こす、したがって、以下の説明に対処する必要があります。カスタムの MATLAB スクリプト記述の解析が実行されます。 高い空間周波数を除外する二次元フーリエ フィルターと raw データをフィルタ リングによってカメラのノイズを最小限に抑えます。フィルターのサイズは、特定の実験的構成 (主システムの開口によって決まります) に合わせて調整する必要があります。注: 光学系より高い空間周波数のイメージ内の機能 (カメラの読み出しノイズ) などの外部ソースから、無視することができます。 ISCAT は対照的にカメラの raw 数から画像に変換します。注: カメラによって検出された信号は、 。iSCAT コントラストとして定義されている、部分が、coverslip によって反映されるこの場合参照光の強さと間の干渉は、と散乱強度 ()。 別の信号をとの興味の粒子が存在しない特定のフレームの時間の平均を計算することによって。結果のイメージは、参照信号を提供します。注: また、アクティブな背景減算手順可能性があります実行する以下の説明で説明したよう。 よるとコントラストを計算 12,14,16。 その後継者からそれぞれの連続したフレームを引いてローリング差分イメージを作成します。注: 残留信号、カバーガラスの表面粗さから、彼らは連続したフレーム内で一定、波面の歪みは効果的にこの手順で削除されます。ローリングの差分は、1 つのフレームから次に発生するタンパク質バインドのみを残して、これらの残差信号を削除します。この動的な背景差分は、長期的なサンプルのドリフトに敏感だから、有益です。 検出とフレームごとに 1 つの粒子をインデックスし、彼らの特定のコントラストと位置を決定ピークを求めるアルゴリズムを適用します。 タンパク質結合イベントのヒストグラムを作成し、その抽出したコントラストを知られていた蛋白質のサンプル14,24からコンパイルされた校正曲線を介してタンパク質質量に関連付ける手順 4.4 で収集した情報を使用します。