Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa
Summary
Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.
Abstract
Des études récentes de patch-clamp de la cellule entière de neurones substantia gelatinosa (SG) ont fourni un grand nombre d’informations sur les mécanismes de la colonne vertébrale qui sous-tendent la transmission sensorielle nociceptive règlement et développement de douleur ou de démangeaisons chronique. Implémentations des enregistrements électrophysiologiques ainsi que des études morphologiques basées sur l’utilité des tranches médullaires aiguës ont encore amélioré notre compréhension des propriétés neuronales et la composition des circuits locaux au journal officiel. Nous présentons ici un guide détaillé et pratique pour la préparation de tranches de moelle épinière et d’enregistrement de germes entiers représentant spectacle et résultats morphologiques. Ce protocole permet la préservation neuronale idéale et peut imiter des conditions in vivo dans une certaine mesure. En résumé, la possibilité d’obtenir une préparation in vitro de tranches de moelle épinière permet aux enregistrements de courant et tension-bride stable et pourrait donc faciliter des enquêtes détaillées sur les propriétés membranaires intrinsèques, des circuits locaux et structure neuronale à l’aide de diverses approches expérimentales.
Introduction
La substantia gelatinosa (SG, limbe II de la corne dorsale de la colonne vertébrale) est un centre d’indiscutablement important relais de transmission et de régulation de l’information sensorielle. Il est composé des interneurones excitateurs et inhibiteurs, qui reçoivent des entrées des fibres afférentes primaires et le système inhibiteur descendant endogène1interneurones les. Ces dernières décennies, le développement de la préparation de tranches médullaires aiguës et l’avènement de l’enregistrement de patch-clamp de la cellule entière ont permis à diverses études sur les propriétés intrinsèques d’électrophysiologiques et morphologiques des SG neurones2, 3 , 4 ainsi que les études des circuits locaux SG5,6. En outre, grâce à la préparation de tranche in vitro la moelle épinière, chercheurs capables d’interpréter les changements neuronaux excitabilities7,8, la fonction d’ion canaux9,10, et 11,12 , dans diverses conditions pathologiques, activités synaptiques. Ces études ont approfondi notre compréhension du rôle que jouent les neurones de la SG dans le développement et l’entretien de la douleur chronique et neuropathique marginé.
La condition préalable essentielle pour obtenir une visualisation claire de soma neuronale et idéal de rapiéçage cellule entière en utilisant des tranches médullaires aiguës est essentiellement, pour assurer l’excellente qualité des tranches sorte sains et patchables neurones peuvent être obtenus. Cependant, la préparation de tranches de moelle épinière implique plusieurs étapes, par exemple effectuer une laminectomie ventrale et enlever la membrane de pia-arachnoïde, qui peut-être être des obstacles pour obtenir des tranches en bonne santé. Bien qu’il n’est pas facile de préparer des tranches de la moelle épinière, effectuant enregistrements in vitro sur des tranches de la moelle épinière présente plusieurs avantages. Par rapport aux préparations de culture de cellules, tranches de moelle épinière peuvent préserver partiellement des connexions synaptiques inhérentes qui sont dans un état physiologiquement pertinent. En outre, cellule entière patch clamp enregistrement en utilisant des tranches de moelle épinière pourrait être combiné avec d’autres techniques, telles que double patch clamp13,14, études morphologiques15,16 et single-cell RT-PCR 17. par conséquent, cette technique apporte des précisions sur la caractérisation de la diversité anatomique et génétique dans une région spécifique et permettant l’étude de la composition des circuits locaux.
Ici, nous fournissons une description préliminaire et détaillée de notre méthode pour préparer les tranches médullaires aiguës et acquérir des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière des neurones de la SG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole détaille les étapes pour la préparation de tranches de moelle épinière, que nous avons utilisée avec succès lors d’expériences de patch-clamp de la cellule entière sur SG neurones18,19,20,21. En appliquant cette méthode, nous avons récemment rapporté que la minocycline, une deuxième génération de tétracycline, pourraient améliorer sensiblement la transmission syn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81560198, 31660289).
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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