Mikrodialyse exzitatorischen Aminosäuren während der EEG-Ableitungen in Ratten frei beweglich

Um Einblick in die Funktionsbeeinträchtigung der Glutamat-vermittelte exzitatorischen und GABAergen inhibitorischen Neurotransmission spontane Anfälle im Temporallappen-Epilepsie (TLE) wodurch überwacht wir systematisch extrazelluläre Konzentrationen von GABA¹ und später die Ebenen von Glutamat und Aspartat-² durch Mikrodialyse im ventralen Hippocampus von Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten der natürlichen Krankheit Kurs, d.h.während der Entstehung und Progression von Epilepsie. Wir nutzten die TLE Pilocarpin Modell bei Ratten, das die Krankheit sehr genau in Bezug auf Verhalten, elektrophysiologische und histopathologische Veränderungen^3,4 imitiert und wir korreliert die Dialysat Konzentration von amino Säuren, die verschiedenen Phasen: die akute Phase nach der epileptogenen Beleidigung, die Latenz-Phase, die Zeit der ersten spontanen Anfall und die chronische Phass^5,6,7. Gestaltung der Phasen der Krankheit wurde durch Langzeit-Video-EEG-monitoring und die präzise EEG und klinische Charakterisierung von spontaner Anfälle ermöglicht. Anwendung der Mikrodialyse Technik im Zusammenhang mit Langzeit Video-EEG-monitoring erlaubt uns, mechanistische Hypothesen für TLE Neuropathologie vorzuschlagen. Zusammenfassend lässt sich sagen ermöglicht die Technik beschrieben in dieser Handschrift die Paarung von neurochemischen Veränderungen innerhalb einer definierten Gehirnregion mit der Entstehung und Progression von Epilepsie im Tiermodell.

Gekoppelte Geräte, bestehend aus einer Tiefe Elektrode an eine Kanüle Mikrodialyse gegenübergestellt werden oft an Epilepsie Forschungsstudien eingesetzt wo Veränderungen der Neurotransmitter, ihrer Metaboliten oder Energie-Substrate mit neuronaler Aktivität korreliert werden sollte. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle es ist in frei Verhalten Tiere verwendet, aber es kann auch in ähnlicher Weise in den Menschen, z. B.bei Pharmaco-resistente epileptischen Patienten Tiefe Elektrode Untersuchung vor der Operation⁸durchgeführt werden. EEG-Aufzeichnung sowohl Dialysat Sammlung kann separat durchgeführt werden (z. B.Implantation der Elektrode in einer Hemisphäre und der Mikrodialyse Sonden in die andere Hemisphäre oder sogar der Mikrodialyse in einer Gruppe von Tieren während der Durchführung das alleinige EEG in eine andere Gruppe von Tieren). Kopplung der Elektroden, Sonden müssen jedoch mehrere Vorteile: es vereinfacht stereotaktischen Chirurgie, Gewebeschäden, nur eine Hemisphäre beschränkt (wobei andererseits intakt, wie ein Steuerelement für histologische Untersuchungen), und die Ergebnisse wie diese homogenisiert ergeben sich aus der gleichen Region des Gehirns und das gleiche Tier.

Auf der anderen Seite erfordert die Vorbereitung des gekoppelten Mikrodialyse Sonde Elektrode Geräts Fähigkeiten und Zeit wenn es hausgemacht ist. Man konnte relativ hohe Mengen an Geld ausgeben, wenn vom Markt gekauft. Darüber hinaus Wenn Mikrodialyse Sonden (Prüfspitzen sind in der Regel 200-400 µm im Durchmesser und 7 bis 12 mm lang) sind⁹und EEG-Elektroden (Elektrodenspitzen sind in der Regel von 300-500 µm im Durchmesser, und lang genug um die Gehirnstruktur von Interesse¹⁰zu erreichen) gekoppelt, stellt das montierte Gerät ein sperriges und relativ schweres Objekt auf einer Seite des Kopfes, die ist für Tiere lästig und fehleranfällig, verloren zu werden, vor allem, wenn es an die Dialyse-Pumpe und die harten Draht EEG Recording-System angeschlossen ist. Dieser Aspekt ist in epileptische Tiere, die schwierig zu handhaben und weniger anpassungsfähig an die Mikrodialyse-Sitzungen sind relevanter. Richtige Operationstechniken und angemessene Nachsorge können dauerhafte Implantate, die minimale Tier Unbehagen verursachen und sollte verfolgt werden, für kombinatorische Mikrodialyse-EEG^10,11, Experimente führen ¹².

Die Vorzüge und Grenzen der Mikrodialyse Technik wurden durch viele Neurowissenschaftler im Detail überprüft. Der primäre Vorteil gegenüber anderen in Vivo Perfusion Techniken (z.B., Push-Pull-schnelle Strömung oder kortikale Tasse Perfusion) ist eine kleine Durchmesser der Sonde, die eine relativ genaue Fläche von Interesse^{13,14, 15}. Zweitens schafft die Mikrodialyse Membran eine physische Barriere zwischen dem Gewebe und dem Perfusat; Daher hochmolekularen Gewicht Substanzen nicht überqueren und nicht stören die Analyse^16,17. Darüber hinaus wird das Gewebe von der turbulenten Strömung Perfusat¹⁸geschützt. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Möglichkeit, Perfusat Fluss zur Maximierung der Analyt-Konzentration in der Perfusat ändern (d. h., der Prozess der Mikrodialyse können mathematisch wohldefinierte und können geändert werden, um hohe Ausbeute Konzentration des Analyten in der Probe)¹⁹. Schließlich kann die Technik, Drogen oder pharmakologisch wirksamer Substanzen in das Gewebe von Interesse zu ziehen und ihre Wirkung am Ort der Intervention²⁰bestimmen verwendet werden. Auf der anderen Seite hat Mikrodialyse zeitlich begrenzte Auflösung (in der Regel mehr als 1 min aufgrund des Zeitaufwands für Probenahmen) im Vergleich zu elektrochemischen oder biologischen Sensoren; Es ist eine invasive Technik, die Gewebeschäden verursacht; Es beeinträchtigt die neurochemische Gleichgewicht in den Raum um die Membran durch die kontinuierliche Konzentration Steigung von allen löslichen Substanzen tritt die Perfusat zusammen mit den Analyten von Interesse. Zu guter Letzt ist die Mikrodialyse-Technik stark beeinflusst durch die Grenzen der analytischen Techniken für die Quantifizierung von Substanzen im Perfusat^9,21,22,23 . Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung mit Orthophthaldialdehyde für Glutamat und Aspartat-Analyse in biologischen Proben gut validierte^{24,25,26 wurde , 27} und seine umfangreiche Diskussion ist außerhalb des Bereichs dieser Handschrift, aber die Daten, die mit dieser Methode werden im Detail beschrieben werden.

Wenn richtig und ohne Änderungen der Zusammensetzung Perfusat durchgeführt, bieten Mikrodialyse verlässlichen Informationen über den basalen Ebenen der Freisetzung von Neurotransmittern. Der größte Teil der basalen Ebenen ist wahrscheinlich das Ergebnis Sender Spillover aus den Synapsen-⁹. Da die einfache Probenahme des Neurotransmitters im extra synaptischen Raum in vielen Fällen nicht ausreichen, um die Ziele einer Untersuchung zu verfolgen ist, kann die Mikrodialyse-Technik auch Neuronen stimulieren oder für sie wichtige berauben eingesetzt werden physiologischen Ionen wie K⁺ oder Ca^{2 +}, um hervorrufen oder verhindern die Freisetzung des Neurotransmitters.

Hohe K⁺ -Stimulation ist oft in Neurobiologie zur neuronalen Aktivität nicht nur wach Tiere, sondern auch in Grund- und organotypischen Kulturen zu fördern. Die Belichtung ein gesundes zentrales Nervensystem zu Lösungen mit hohen Konzentrationen von K⁺ (40-100 mM) erinnert an die Fluth von Neurotransmittern²⁸. Diese Fähigkeit von Nervenzellen, eine zusätzliche Freisetzung als Reaktion auf hohe K⁺ möglicherweise epileptische Tiere¹ und in anderen neurodegenerativen Krankheiten^29,30gefährdet. Ebenso die Ca^{2 +} Entzug (durch Vorrichtung Ca^{2 +} kostenlose Lösungen erhalten) verwendet wird, um Kalzium-abhängige zu etablieren-release von die meisten Neurotransmitter Mikrodialyse gemessen. Es wird allgemein angenommen, dass Ca^{2 +} abhängige Release neuronalen Ursprungs, während Ca^{2 +} unabhängige Freisetzung aus Glia stammt, aber viele Studien Kontroverse über die Bedeutung von Ca^{2 hoben +}-empfindliche Messungen von z.B. Glutamat oder GABA⁹: also, wenn möglich, es empfiehlt sich, Mikrodialyse Studien mit Reinstraum Studien zu unterstützen, da diese letztere haben eine höhere räumliche Auflösung und die Elektroden näher an Synapsen³¹.

Bei epileptischen Mikrodialyse Tierstudien ist es wichtig zu betonen, dass die meisten von ihnen gewonnenen Daten verlassen sich auf video oder Video-EEG Überwachung der Anfälle, d. h., das vorübergehende Auftreten von Anzeichen oder Symptome durch abnorme übermäßige oder synchrone neuronaler Aktivität im Gehirn³². Es gibt einige Besonderheiten der elektrographischen Anfälle bei Tieren Pilocarpin behandelt, die berücksichtigt werden sollten, wenn Sie das Experiment vorbereiten. Spontane Anfälle treten in Clustern^33,34und deprimiert Tätigkeit mit häufigen EEG korreliert Spitzen³ folgt. Schein operierten nicht-epileptische Tiere Beschlagnahme-ähnliche Aktivität³⁵ aufweisen können sollte und daher die Parameter für EEG-Aufnahmen Bewertung standardisierte³⁶ und, wenn möglich, sollte das Timing der Mikrodialyse Sitzungen gut definiert werden. Zu guter Letzt empfehlen wir nach den Prinzipien und methodische Standards zur Video-EEG Überwachung bei Erwachsenen Nagetieren Kontrolle von Experten der internationalen Liga gegen Epilepsie und amerikanischen Epilepsie Gesellschaft in ihren jüngsten Berichten^{37 beschrieben. ,38}.

Hier beschreiben wir Mikrodialyse Glutamat und Aspartat-parallel mit der langfristigen Video-EEG-Ableitungen epileptische Tiere und deren Analyse in das Dialysat durch HPLC. Wir werden die entscheidenden Schritte des Protokolls zu betonen, die man für das beste Ergebnis kümmern sollte.