모델을 새로운 시험관에 폭발 외상 성 뇌 손상의

이 원고에 설명 된 실험 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986의 준수 했 고 동물 복지 및 윤리 검토 본문의 임페리얼 칼리지 런던에 의해 승인 되었습니다. 동물 보호는 임페리얼 칼리지 런던의 기관 지침을 준수 했다. 1. hippocampal Organotypic 슬라이스 준비와 문화 참고:이 프로토콜 인터페이스 방법 Stoppini와 동료 사소한 수정21,,2223설명 organotypic hippocampal 조각의 생산 수 있습니다. 이상적으로, 더 이상 세 동물 안락사 하 고 각 단계는 신속 하 게 이루어집니다 보장 조각의 품질 저하를 방지 하 고 한 세션에서 해 부 될 해야 합니다. 통해 무 균 기술을 사용 합니다. 해 부 프로토콜을 시작 하기 전에 다음 단계를 수행 하는 확인 하십시오. 준비 하 고 필터 소독 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 사전에 모든 솔루션. 계속 저장 동안 및 뇌 해 부와 금속 방열판에 저장 그릇 및 접시를 유지 하 여 hippocampal 슬라이스 준비 4 ° C에서 솔루션 항상 젖은 얼음에 앉아. 오토 클레이 브 모든 금속 계기, 반지 및 종이 조직. 모든 악기와 프로토콜의 각 단계에 사용 될 재료 준비가 사용, 사전에 계획 하 고 70% 에탄올 뿌리 확인. 그들은 진정 하 고 건조 허용 되는 확인 하십시오. 5-7 일 안락사-오래 된 C57BL/6N 강아지 자 궁 경부 전위에 의해 마우스와 짧게 전체 피부 표면 살 균 종이 조직 70% 에탄올에 적셔 닦아. 건조 피부를 두 드려 고 메이 위를 사용 하 여 강아지 목을 벨. 머리 후 두 지역에서 시작 하 고 주 둥이 근처 결말의 중간 선 따라가 위로 아이리스 두 피 피부를 잘라내어 옆으로 그것을 철회. 구멍 매그넘에 욕실이 위 끝을 삽입 하 고 가로 sinuses 따라 뼈에 두 개의 작은 측면 상처를 만들 다음 嗅까지 중간 선 따라 두개골을 잘라이 지역에서 중간에 수직으로 두 개의 작은 상처 확인. 잘 사용 하 여 곡선된 겸 자, 옆으로 중간에서 뼈의 플랩 철회, 신중 하 게 작은 주걱으로 두뇌를 제거 가리키고 90 m m 실리콘 탄성 중합체 코팅 페 트리 접시 포함 하는 “해 부 매체”에 그것을 전송.주: 해 부 매체 Gey의 균형 (5 mg/mL D-포도 당, 10000 단위/mL 페니실린, 10 mg/mL 스와 25 µ g/mL 암포 B 1% 항생제 antimycotic 솔루션) 소금 솔루션입니다. 소 뇌를 제거 하 고 면도날을 사용 하 여 중간 선 따라 대뇌 반구를 분리. 주걱을 사용 하 여 새로운 90 m m 실리콘 탄성 중합체 코팅 페 트리 접시 가득 신선한 얼음 처럼 차가운 해 부 매체에 대뇌 반구를 전송. 하나 이상의 동물 한 세션에서 사용 될 것 이다, 단계 1.2-1.6을 반복 합니다. Stereomicroscope에서 嗅과 면도날으로 담당의 끝을 잘라 하 고 대뇌 피 질 좋은 팁 집게를 사용 하 여 뇌 조직의 나머지 부분에서 분리 합니다. 이 단계는 해 마는 대뇌 피 질의 조직의 내측 표면에 노출 나뭇잎. 앞으로이 단계에서 층 류 조직 문화 후드 (자외선 살 균 및 70% 에탄올 용액으로 세척)를 사용 합니다. 평평한 플라스틱도 마 디스크에 얼음 처럼 차가운 해 부 매체를 적용 하 고, 외피의 중간 표면 위로 향하도록 고 해 마의 축이도 마 칼 날의 축에 수직이 되도록 디스크에 뇌 조직의 위치는 주걱을 사용 하 여. 좋은 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 자르고 디스크에서 해 부 매체의 가능한 한 많이 제거 합니다. 두뇌 조직 헬기를 사용 하 여 50%도 마 속도 400 µ m 조각으로 잘라와 강제.참고:이 단계는 가능한 한 빨리 뇌 조직 절 개 매체에 잠긴 하지는 작업 매우 중요 하다. 신선한 얼음 중간에 실리콘 엘라 스토 머 코팅 페 트리 접시에 해 부 매체를 바꿉니다. 조직 헬기 완료 되 면 신중 하 게 잠수함 신선한 절 개 매체에 뇌 조직 그리고 컷된 조직 다시 90 m m 실리콘 탄성 중합체 코팅 페 트리 접시에 직선 블레이드 메스를 사용 하 여 전송. Stereomicroscope에서 신중 하 게 좋은 팁 집게를 사용 하 여 대뇌 피 질의 조각 구분 합니다. 각 조각에 대 한 형태학 및 잠재적인 조직 손상에서 해 부 결과 또는 슬라이스 해 마 검사. 좋은 팁 겸과 작은 욕실이 위를 사용 하 여 fimbria entorhinal 외피에서 오가는 된을 구분 합니다. 일반적으로, 약 6 ~ 8 hippocampal 조각 반구 당 생성 됩니다. 최대 6 hippocampal 조각 컷을 사용 하 여 조직 문화 삽입 전송 파스퇴르 피 펫 및 장소 안에 35 mm 페 트리 접시. 조각 몇 밀리미터 간격 (이렇게 하면 각 슬라이스를 개별적으로 수행해 수) 보급 되어 있는지 확인 합니다. 즉시 차가운 추가 테두리를 삽입 하는 “성장 매체” 각 페 트리 접시의 바닥에 조직 문화 삽입 아래 조직 문화의 상단 바로 아래.참고: 성장 매체 포함 50% 최소 필수 매체 독수리, 25% 행 크 스 소금 솔루션, 25% 말 혈 청, 5 mg/mL D-포도 당, 2 mmol/L L-글루타민, 1% 항생제 antimycotic 솔루션, 그리고 10 mmol/L HEPES, 수산화 나트륨으로 pH 7.2에 적정 균형. 성장 매체는 절 개 후 일과 다음 2 ~ 3 일 마다 그 후 (37 ° C에서 사용 성장 매체)를 변경 합니다. 성장 매체 추가 됩니다 충분 한 금액, 하지만 너무 많은 조직 조각의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 조직 문화 삽입 막에 오버플로 확인 하십시오. 12 ~ 14 일 실험에 사용 되 고 이전에 대 한 5% 이산화탄소 공기에서 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 조직 조각을 유지. 2. 준비 Hippocampal Organotypic 조각의 실험 폭발 TBI 프로토콜에 대 한 참고: 이미지를 제외 하 고이 섹션의 모든 단계는 층 류 두건은 조직 문화에 자리를 차지할. 6 잘 플레이트 (잘 당 하나)로 주문 품-스테인리스 링을 삽입 합니다.참고 사항: 고리 (이 12 시 위치에 앉아서 해야) 노치 테두리 고 웰 스, 조직 문화를 삽입 하는 동안 내부 석판에 맞는이 림에 쉽게 맞는. 확인 반지는 살 균 소독 제와 세척, 철저 하 게 압력가 순화 된 물으로 씻어 서 미리 진정 허용. 혈 청 무료 미리 따뜻하게 (37 ° c) 6 잘 플레이트의 우물을 채우기 propidium 요오드 화와 함께 “실험 매체”.참고: propidium 요오드 화물와 실험 매체는: 75% 최소 필수 매체 독수리, 25% 행 크 스 소금 솔루션, 5 mg/mL D-포도 당, 2 mmol/L L-글루타민, 1% 항생제 antimycotic 솔루션, 10 mmol/L HEPES, 4.5 µ / L propidium 요오드 화물, 적정 한 pH 균형 to 수산화 나트륨과 7.2. 매체의 레벨 링의 노치 위에 도달 하지 않는 확인 하십시오. 6 잘 플레이트 반지와 매체 조직 문화 삽입 전송 직전 37 ° C에는 되도록 1 시간에 대 한 보육 다시 전송. 고리와 6 잘 플레이트와 포 셉와 함께 실험 매체에 35 mm 페 트리 접시에서 organotypic 조각으로 조직 문화 삽입을 전송. 영구 마커 펜으로 점 3 시 위치에 삽입에 확인 하십시오.참고: 삽입 실험 기간 동안 6 잘 플레이트에서 제거 하 고이 단계를 용이 하 게 삽입을 원래 위치로 돌아가는 충격파 노출 후와 쉽게 추적 하는 프로토콜을 통해 각 슬라이스. 고유 이름 및 날짜와 함께 각 6 잘 플레이트 고 명명 각 잘 각 격판덮개의 우물의 지도 (예., A, B, C, 등.) 각 잘에서 각 조각 (예., 1, 2, 3, 등.), 각 조각에는 고유 식별자 ( 예를 들어., A1, A2, A3, 등.). 6 잘 플레이트 되도록 조각 이미징 직전 37 ° C에서 1 시간에 대 한 보육을 전송 합니다.주: 매체의 오버플로 방지 또는 조직 문화 아래 공기의 모든 거품 삽입 조각의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 막. 실험적인 매체에 전송 후 1 시간, 각 이미지 조각 부상 전에 슬라이스 상태를 평가 하는 적절 한 자극 (BP 535/50 nm), 방출 (LP 610 nm) 필터 형광 현미경 (2 X 목표, 나 0.06)를 사용 하 여 개별적으로 프로토콜은 수행 된다.노트: 짙은 빨간색이이 단계에서 얼룩의 영역을 전시 조각 손상된 가능성을 제시 하는으로 간주 한다와 (이 일반적으로 생성 하는 조각의 총 수의 10% 미만 대표) 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 이미징 및 슬라이스 인큐베이터 밖에 있는 시간을 최소화 하기 위해 가능한 한 신속 하 게 순차적으로 수행 됩니다 확인 (일반적으로 6 우물 바로 아래 30 분을 취해야 이미지). 항상 6-잘 접시의 뚜껑을 유지. 일부 결로 뚜껑의 안쪽에 쌓일 수 있습니다. 이 경우, 낮은 조정에 짧게 헤어 드라이어를 사용 합니다. 다른 일에 그리고 실험 사이 모든 이미징 조건 동일 인지 확인 합니다.참고: 이미지의 목표는 조직의 형광 계량, 그러므로이 단계는 중요 한 결과의 재현성을 보장 하 고 얻은 데이터의 비교를 허용. 3. 침수 및 조직 문화의 전송 Hippocampal Organotypic 조각으로 삽입 이미징, 직후 층 류 두건에 집게를 사용 하 여 6 잘 플레이트에서 하나의 조직 문화 삽입을 가져가 라. 조심 스럽게 멸 균 폴 리 에틸렌 가방 (3 “x 5”)을 삽입 미리 가득 따뜻한 (37 ° C) 실험 매체의 20 mL 갓 이전 95% 산소와 5% 이산화탄소와 버블링.주: 산소와 이산화탄소 농축된 실험 매체와 95% 산소와 5% 이산화탄소 Dreschel 병 안에 scintered 유리 bubbler를 사용 하 여 적어도 40 분 동안 부풀어 되었고 내부 살 균 폴 리 에틸렌 봉지에 전송 확인을 층 류 조직 문화 후드 세균성 필터와 연결 된 무 균 충전 튜브 (127 mm) 20 mL 주사기를 사용 하 여. 즉시 가방을 봉인 하 고 조직 문화 삽입 전송 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C 배양 기에 그들을 전송. 각 균 가방 (와 플레이트 잘 식별) 표시 올바르게 확인 합니다. 각 조직 문화 삽입에 대 한이 단계를 반복 합니다. 멸 균 가방 (가방 상단의 복잡 하 고 플라스틱 클램프를 적용 하 여 안전 하 게 수행) 씰링 시 신중 하 게 공기 방울을 제외 합니다. 37 ° C 배양 기에 조직 문화 삽입과 살 균 가방과 실험 매체 6 잘 플레이트를 반환 합니다. 1 시간 후 신중 하 게 생리 온도 쇼크 웨이브 노출 동안에 organotypic 조각을 유지 하기 위해 37 ° C에서 드 이온된 물으로 채워진 열 레 귤 레이트 된 상자 안에 플라스틱 상자에 조직 문화 삽입과 살 균 가방을 싸 프로토콜입니다. 4. 충격 관 그리고 Hippocampal Organotypic 슬라이스 충격파 노출의 준비 충격 튜브와 충격파 노출의 준비 하는 동안 실험실 코트와 장갑, 강철 발가락 보호 부츠를 착용 하십시오. 멸 균 가방 홀더 프레임 중앙 구멍 (블랭킹 막대를 사용 하 여) 충격 관 출구에 맞춰집니다 보장 충격 튜브 원심 플랜지 볼트 합니다. 광선 2 압력 트랜스듀서 마운트: 구동된 섹션 및 충격 관 (그림 1A)의 원심 플랜지 2 센서의 중간 부분에 센서 1. 현재는 소스 장치를 통해 오실로스코프를 압력 트랜스듀서를 연결 합니다. 모든 충격 튜브 릴리스 밸브 및 흐름 제어 닫혔는지 확인 합니다. 외부 압축 공기 라인 열고 2.5 바 솔레노이드 밸브를 충전 합니다. 압축 공기 실린더 안전 밸브를 열고 천천히 약 5 바 압력을 증가 하는 압력 레 귤 레이 터를 엽니다.참고:이 레 귤 레이이 터에 대 한 설정 압력은 약간 높은 횡 경 막 파열 압력 이상 이어야 한다. 10 x 10 cm2 사각형으로 절단 23 µ m 두께 폴리에스터 시트에 의해는 다이아를 준비 합니다. 핸들 고압 테이프를 사용 하 여 및 각 격 막의 상하에 그들을 준비 합니다. 위치를 한 다이어 프 램 (더블 불 감 증-단일 막 구성의 단일 슬롯) 또는 2 개의 격 막 (두 슬롯의 이중 불 감 증-더블 다이어 프 램 구성) 불 감 증 (그림 1B)에. 격 막, 센터 그리고 4 M24 볼트와 너트를 사용 하 여 순차적으로 대각선 대칭 방법에서 그들을 체결 하 고는 다이아는 되도록 그들을 클램프 주름-무료. 클램프 홀더 프레임에 수직 위치에서 개별적으로 각 살 균 가방, 충격 관 콘센트 직면 조직 배양의 표면 organotypic hippocampal 조각으로 삽입 보장 하 고 내부는 무 균 조직 문화 삽입 중심 가방 (그림 1C)입니다. 멸 균 가방 고르게 동원 정지 되도록 주위 안전 하 게 고정은 다는 것을 확인 하십시오. 충격 관을 압박 하는 때 귀 수비수와 안전 안경을 착용 하십시오. 현재 소스 전원 장치 및 오실로스코프를 쇼크 웨이브 데이터 (50 메가-샘플/s, 레코드 길이 20 ms의 획득 율, 1 백만 점)를 취득 한 솔레노이드 밸브에 스위치. 드라이버 볼륨 섹션 및 이중 다이어 프 램에 대 한 충격의 이중 불 감 증 섹션 모두 또는 하나의 격 막 구성에 대 한 충격 관의 드라이버 볼륨 섹션 압력솥 천천히 흐름 조절기를 사용 하 여 충격 튜브 컨트롤 패널에서 구성입니다.참고: 단일 막 구성에 대 한 파열 압력에 따라 달라 집니다만 격 막 물자 그리고 두께 횡 경 막 것입니다 파열 저절로 파열 압력 자료에 도달 하면. 더블 다이어 프 램 구성에 대 한 파열 압력 또한 차동 드라이버와 더블 볼 기 챔버 가스 압력에 따라 달라 집니다. 그리고 제어 방식으로 파열 격 막에 대 한 이중 불 감 증 안전 밸브는 수동으로 한 번 열 목표 압력 도달 된다. 최대한 빨리 막 신속 하 게 (시끄러운 소음 생산)을 파열 흐름 노브를 사용 하 여 압축 공기 흐름 닫고 솔레노이드 밸브를 엽니다.참고: 드라이버 섹션의 총 볼륨 세그먼트, 광범위 한 충격파 피크 압력 그리고 기간을 얻을 수 있도록 블랭킹의 삽입에 의해 수정할 수 있습니다. 쇼크 웨이브 매개 변수의 이상적인 조합을 조직 부상을 일으킬 충분 해야 하지만 너무 높은 그것이 조직 문화 삽입 또는 살 균 가방 왜곡 또는 파열 됩니다. 조직 문화 삽입 단일 충격파 관을 각 살 균 가방 하 고 그것은 즉시 반환 온도 통제 상자 새로운 멸 균 가방 상자에서 가져온와 홀더 프레임에 고정 하기 전에. 단계 4.10-4.14 수행 원활 하 고 신속 하 게 최대한으로 (몇 분) 이내, 실험 중간 냉각을 방지 하기 위해 온도 37 ° c 부상 개발을 방해 수 있습니다 확인 합니다. 일단 모든 조직 문화 삽입 노출 되었을 원래 6 잘 플레이트를 잘 (내 층 류 조직 문화 후드) 그들의 각각을 반환 조직 문화 삽입을 충격파 (또는 가짜 프로토콜), 그리고 인큐베이터 돌아갑니다. 추가 영상까지 37 ° C에서 공기에 5% 이산화탄소와 인큐베이터에 6 잘 플레이트 유지. 가짜 조각 충격파 노출 함께 각 실험에 대 한 컨트롤을 포함 합니다.참고: 가짜 조각 처리 됩니다 동일 조각 (실험 매체와 멸 균 봉투에 봉인, 동일한 온도 통제 상자에 충격 관 실험실으로 이송 및 해당 기간에 대 한 금속 프레임에 중단 충격파에 노출 시간) 충격 하지만 관을 해 고. 5. hippocampal Organotypic 슬라이스 부상 정량화 24 시간, 48 h 72 h에서 단계 2.8 및 2.9에서 설명한 대로 슬라이스 이미지. 72 h 게시물 충격파 노출에서 이미징, 후 삭제 다음 로컬 생물학 프로토콜을 낭비 하 고 치료 하는 조직 및 고압 금속 고리.