Обнаружение 3-Нитротирозин в атмосферных условиях через высокую производительность системы жидкого хроматографии электрохимический детектор
Summary
Мы представляем метод для обнаружения химических модификаций 3-Нитротирозин атмосферных белков с 6 раундов мм в диаметре, вырезанные из Префильтры пробоотборник воздуха с помощью высокопроизводительных жидкого хроматографии электрохимический детектор (ВЭЖХ-ECD).
Abstract
3-Нитротирозин (3-NT) генерируется из остатков тирозина в атмосферных био аэрозоля белков через реакцию с озоном (3O) и двуокиси азота (NO2). Стабильные 3-NT является конкретным маркером оксидативное повреждение и сообщается пропагандистских воздействие вызывают аллергии. В настоящем исследовании мы сообщают о разработке высокочувствительный пробирного для количественного определения 3-NT в воздушных фильтрах сборники для сбора < 2,5 мкм твердых частиц (2,5м) от городского воздуха окружающей среды, включая био аэрозоля. В этом методе, диаметром 6 мм круглое отверстие был вырезанные из фильтры отбора проб воздуха и смешивают с неспецифическими протеазы коктейль для Гидролизуют протеины. Для 3-NT с использованием высокопроизводительных жидкого хроматографии электрохимический детектор (ВЭЖХ-ECD) были протестированы образцы белок усваивается до уровня аминокислот. Максимальное содержание 3-NT был обнаружен в предфильтр для вечера размеров от 4.5 до 7,3 мкм, с пределом обнаружения 1,13 ПГ/м3.
Introduction
Аэрозоль или бортовых PM содержит белки от различных биологического происхождения, в том числе вирусов, прокариотов, грибов, растений (пыльца) и животных (насекомые, человека)1. Соотношение содержания белка в Личку оценивается в около 5%, что было вовлечено играть важную роль в качестве бортовых аллергенов2. Недавние сообщения указывают что городского атмосферного аэрозоля различных размеров содержат аминокислоты с соотношения колеблется от 0,5% и 2%3. Кроме того химические модификации белков вечера было предложено быть порождена реакции белков с различных загрязнителей, таких как O3, диоксид азота (NO2) и диоксида серы (SO2)4.
3-NT — модификация белков — генерируется азотирования остатков тирозина. Было показано, что более высокая концентрация O3 и2 содействие азотирования белковых молекул в псевдо-атмосферные пространства5,6. Азотирования остатков тирозина в цепи полипептида повышает аллергенным потенциалом пыльцы белки7. Таким образом количественного определения и оценки бортовых 3-NT является важным аспектом в решении проблем охраны окружающей среды.
3-NT также известен как биомаркер от окислительного и нитрозилирующий подчеркнуть8. Новые совокупность доказательств показал значительный ассоциации 3-NT содержимого с несколькими заболеваниями человека9,10. Благодаря его пагубные последствия, выявление и количественная оценка 3-NT в биологическом образце проводят большое значение в определении состояния здоровья индивидуума. В последние годы, были введены различные методы для оценки содержания 3-NT, включая иммуноферментного анализа, ВЭЖХ и LC/MS11. В предыдущих исследованиях мы сообщали метод обнаружения, с помощью метода ВЭЖХ-ECD даровал с рядом преимуществ, по сравнению с предыдущими методами. Например ВЭЖХ-ECD не требует извлечения или деривации процедуры, что делает его относительно простой пробирного системы12. Мы подтвердили, что этот метод применим для обнаружения 3-NT от биологических образцов (плазмы от человека и крысы).
Хотя многие исследования подчеркнули обнаружения 3-NT в биологических образцах, его обнаружения в пробах небиологического остается недостижимым, и следовательно проводилась настоящего исследования. В самом деле чтобы оценить вредного воздействия переносимых по воздуху 3-NT, количественный метод, который является полезным для обнаружения 3-NT непосредственно из частиц требуется; Таким образом, мы применили существующий метод ВЭЖХ-ECD обнаружить 3-NT от PM2.5 собранные на стекло волокна фильтра. Используя технику, 3-NT могут быть обнаружены непосредственно от небольших кусков (диаметром 6 мм круглые отверстия) образец из коллекции фильтра вечера. Далее мы оценили содержание 3-NT для различных размеров вечера и измеряется предел обнаружения 3-NT. Настоящей статьи предлагает высокочувствительные и высок объём метод для обнаружения 3-NT непосредственно из небиологического и биологических образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья описывает метод количественной оценки 3-NT в воздухе ТЧ, собранные на quartz-фильтры, с помощью высокочувствительных методов ВЭЖХ-ECD.
В целом методы измерения 3-NT были разработаны в качестве биомаркеров оксидативного стресса в заболеваниях человека. Методы, основанные на антитела (например, энзим соединенный assay иммуносорбента) считаются полуколичественного, потому что нет никакой проверки строгого анализа и трудно оценить надежность теста. ВЭЖХ с электрохимической обнаружения (ECD) и массы на основе спектрометрии анализов имеют адекватные чувствительность для количественной оценки 3-NT13. Хотя они являются чувствительными, массы на основе спектрометрии методы как GC-MS или GC-MS/MS требуют деривации аминокислот, и процесс деривации часто приводит к образованию артефактов14.
По сравнению с методами GC и LC, ВЭЖХ-ECD относительно менее дорогим и обладает достаточной чувствительностью к мера 3-NT. Кроме того, деривации шаг в LC-MS и GC-MS часто требует дополнительного времени. Хотя метод, представленные здесь требует 16 часов для шага переваривания белка, он может тем не менее, осуществляться на ночь (как описано выше, около 30 минут руки времени требуется на сэмпл). Автоматическое повторное измерение, используя Автоматический пробоотборник может предоставить система измерения высокой пропускной способности. Предыдущие исследования сообщили иммунологические методы измерения 3-NT в PM2,7; Однако такие методы не удалось обнаружить 3-NT в зимний сезон из-за низкого уровня 3-NT в PM15.
Метод ВЭЖХ-ECD имеет дополнительные преимущества по сравнению с другими стандартными методами; например (i процесс извлечения не требуется в этом методе, (ii) это полностью свободной от моющих средств, (iii) он имеет минимальный пример требование, и, главное, (iv) он имеет высокую чувствительность. Частицы, которые собираются на фильтры часто отделены sonication для дальнейшего расследования, включая количественную оценку различных компонентов. Моющие средства используются также для изоляции PM-прыгните белки от фильтров. Однако, эти дополнительные шаги повышают риск загрязнения, образец потери и недооценка благодаря эффективности добычи, и Кроме того, большинство моющих несовместимы с LC/МС. В рамках нынешнего метода ВЭЖХ-ECD ВЭЖХ образцы легко может быть отделена от фильтра, с помощью простой полых удар и без требования дополнительного пример процесса подготовки. Пример-округлой формы площадью 28,3 мм2, который очень мала по сравнению с размером исходного quartz-фильтр (8 x 10 дюймов = 203.2 x 254 мм = 51,600 мм2).
ВЭЖХ-ECD условие оставлено тщательно во избежание помех на сигнал 3-NT, как описано ранее12. Сильный кислый рН мобильных фазы и надлежащей концентрации Ацетонитрил имеет важное значение для обнаружения. С помощью этих условий, других соединений, в том числе нитро базы, могут быть отделены от Нитротирозин. Нынешнее состояние подходит для обнаружения 3-NT от образцов с различные физические свойства (например, твердых частиц и плазмы).
Для оценки 3-NT в воздухе, измерения веса фильтра и ликвидация фона являются важнейшие шаги. В общем над приблизительно 100 мг7 вечера собираются в течение четырех до семи дней; Однако некоторые факторы влияют на вес фильтра до и после вечера7 коллекции, включая влажность и статического электрического заряда. Чтобы избежать этих последствий, стабилизация веса фильтра для длительных периодов необходим при subequal температуре и влажности. Место, где установлен электронный баланс должен сохраняться в стабильных условиях. Для пробоподготовки важно исправить эффекты фона от неспецифических протеазы коктейль и ультрафильтрационные мембраны, которые часто показывают аналогичные пик 3-NT.
Этот метод может применяться к другим частицам, в том числе в помещениях. Азотирования белков может увеличить их аллергенные потенциальных2. Таким образом этот метод может помочь оценить экологическую чистоту и предотвратить стресс нитрозилирующий.
В этом исследовании мы приводим метод высокочувствительных измерения атмосферных 3-NT воздушных фильтров сборники с легким в обращении и недорогой аппарат. Поколения 3-NT в атмосфере ассоциируется с экологических загрязнителей, таких как O3, не2, пп белков и метеорологических элементов, которые влияют на человека аллергенностью. В заключение метод, разработанный в ходе настоящего расследования может помочь оценить атмосфере реакции O3, различных загрязнителей и вечера белков в различных метеорологических условиях. С этих усилий развивающихся ВЭЖХ-ECD для оценки 3-Нитротирозин в атмосфере мы ожидаем более экологической чистоты, улучшение здоровья человека.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Масаюки Kubo нас окружающей среды Агентства по охране за его помощь с выборки2,5 л/м. Эта работа частично поддержали JSP-страницы KAKENHI Грант номер JP16K15373 и JP18H03039.
Materials
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
Referências
- Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
- Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
- Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
- D’Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
- Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
- Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
- Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
- Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).
- Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
- Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?. Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
- Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
- Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
- Ogino, K., Wang, D. -. H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
- Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
