Yetişkin zebra balığı sözlü entübasyon: bağırsak alımını biyoaktif bileşiklerin değerlendirmek için bir Model
Summary
Protokol entübasyonda yetişkin zebra balığı ile bir biyolojik açıklar; daha sonra Diseksiyon ve bağırsak sitometresi, confocal mikroskobu ve qPCR için hazırlanıyor. Bu yöntem yönetime biyoaktif bileşiklerin bağırsak alımı ve uyarılmış yerel bağışıklık uyarıcı izlemek için izin verir. Sözlü prezervatiflerinin bağırsak dinamiklerini test etmek için uygundur.
Abstract
Çoğu patojen organizmalar onların mukoza yoluyla istila. Onlar sürekli bir mikrobiyal zengin su ortamına maruz kalır gibi bu özellikle balık doğrudur. İmmunostimulants veya bulaşıcı hastalıklara karşı bağışıklık sistemi harekete geçirmek, aşı oral teslim etmek için etkili yöntemler geliştirmek son derece arzu edilir. Profilaktik araçlar oluşturulması, iyi modeller onların performansını test etmek için ihtiyaç vardır. İşte, Yetişkin zebra balığı sözlü entübasyon için bir yöntem ve incelemek ve bağırsak sitometresi, confocal mikroskobu ve nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için hazırlamak için yordamlar kümesi göstermektedir. Bu iletişim kuralı ile tam 50 µL hayvanlara zarar vermeden basit ve hızlı, yaklaşık 1 g ağırlığında Balık ye yönetebilirsiniz. Bu yöntem fluorescently etiketli bileşikler doğrudan vivo içinde alımını entübasyon sonra bağırsak mukoza ve yerel sitesinde böyle destekte immunomodulatory kapasitesini keşfetmek için bize izin verir. Akış Sitometresi, histoloji, qPCR ve bağırsak dokusu confocal mikroskobu gibi aşağı akım yöntemleri birleştirerek, biz nasıl immunostimulants veya aşı intestinal mukozal engelleri çapraz, lamina propria geçmek edebiliyoruz anlayabiliyorum ve barsak mukozal bağışıklık sistem üzerinde bir etkisi uygulamakla kas ulaşmak. Model aday sözlü donlarını ve dağıtım sistemleri veya herhangi bir sözlü olarak yönetilen biyoaktif bileşik yerel etkisini test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Bu makalenin amacı ile birlikte yararlı ilişkili karşıdan akış yordamları zebra balığı sözlü entübasyon için basit bir yöntem derinlemesine tarif etmektir. Zebra balığı kullanarak sözlü entübasyon bulaşıcı hastalığı dinamikleri, sözlü aşı/immunostimulant, uyuşturucu/nanopartikül alımı ve etkinlik ve intestinal mukozal bağışıklık çalışmanın pratik bir model haline gelmiştir. Örneğin, zebra balığı sözlü entübasyon Mycobacterium marinum ve Mycobacterium peregrinum enfeksiyon1çalışmada kullanılmıştır. Lovmo vd. aynı zamanda başarılı bir şekilde bu model nano tanecikleri ve M. marinum yetişkin zebra balığı2mide-bağırsak sistemi için teslim etmek için kullanılan. Buna ek olarak, Chen ve ark. zebra balığı sözlü entübasyon ilaçlar nano tanecikleri tarafından Kapsüllü göstermek için kullanılan ne zaman yönetilen yolu ile belgili tanımlık mide-bağırsak arazi taşınan arasında kan beyin bariyerini3. Bu yazarlar Collymore vd tarafından açıklanan gauvage yöntemine dayalı entübasyon yapılır 4 bazı değişikliklerle. Ancak, sözlü entübasyon işlemi açıklayan bir çok detaylı protokol sağlamadı. Burada, Collymore ve ark. üzerinde bina yetişkin zebra balığı sözlü entübasyon için bir yöntem mevcut 4 biz daha fazla bağırsak hazırlanması için ilgili karşıdan akış analiz sitometresi, confocal mikroskobu ve qPCR içermektedir.
Bağırsak ve özellikle onun mukoza enfeksiyona karşı savunma ilk satırı ve besin alımını5birincil site olduğunu. Epitel hücreleri ve antijen sunan hücreler mukozal engelleri içinde tehlike sinyalleri algıladıkları zaman hemen doğuştan gelen bağışıklık yanıt tetiklenir. Ardından, son derece belirli edinilmiş bağışıklık yanıtı T ve B lenfositler6,7tarafından kuruldu. Sözlü aşıların geliştirilmesi vaccinology geçerli bir odak alanıdır. Böyle aşılar mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT)8,9bağışıklık hücreleri belirli tepki nedeniyle maruz sitelerdeki organizma korumak için etkili bir araç olurdu. Su ürünleri yetiştiriciliği, mukozal aşı enjekte edilebilir aşılar için karşılaştırıldığında belirgin avantajları var. Onlar için kitle aşı, daha az emek yoğun pratik, balık için daha az stresli ve genç balık yönetilemez duruma gelir. Yine de, mukozal aşı adaylar sözlü ortamda denatüre olmadan ikinci gut segment ulaşmalıdır. Onlar da hücreleri (ZPT) yerel ve/veya sistemik yanıt-e doğru10ikna etmek için sunulması antijen erişim kazanmak için mukozal engelleri aşıyorlar. Dolayısıyla, aday sözlü antijenleri ve onların teslim sistemleri tarafından elde mukozal alım testi, uyarılmış, immün yanıt yanı sıra sözlü aşıların geliştirilmesi esastır.
Biyomedikal bir bağlamda sonra sözlü entübasyon büyüyen ilgi bileşiklerin biyolojik etkileri test etmek için bir model geliştirilmesi. Bağırsak anatomik ve fizyolojik özelliklerin çoğu memeliler ve kemikli balıklar11ile bilaterian soy arasında korunmuş. Aşağı akım analizi için bağlı bu sözlü entübasyon model insan biyolojisi, hem de bir deneme alanı içine anlayışlar için destekte sağlamak için bir araç olabilir veya diğer vivomaddeler ve birleşimler.
Örneğin, bir yüksek sağkalım oranı ile tartı 1 g balık protein nanopartikül süspansiyon 50 µL başarıyla yöneten bir operatör tarafından sözlü entübasyon Protokolü gerçekleştirilebilir. Kurmak basit ve hızlı bir yöntemdir; 30 balık 1 h entübe. Kalite hücre ve doku örnekleri daha sonraki analiz için sunmak için anahtar bağırsak hazırlık için kuralıdır. Akış aşağı sonuçları örnekleri için bağırsak alımı ile ilgili veri alma ve kalite RNA qPCR için izole protokol ‘s kullanışlılığı show verilir. Protokol bu sözlü prezervatiflerinin dinamiği veya diğer bileşikler bağırsaklarda test etmek için uygun bir model ihtiyacı için büyük yararı olur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı bir Collymore vd tarafından sözlü entübasyon için yukarıda açıklanan teknik gelişmedir 4 bizim protokol sözlü entübasyon yöntemi ayrıntılı olarak açıklar ve aşağı akım analizleri için bağırsak hazırlanması içerir. Bizim yöntem tüm iletişim kuralı hızla, operatörler arasında çok varyasyon olmadan yerine getirmek için bir kişi izin balık işleme hızını artırır. Biz sadece hayvan refahı için gözlem tarafından sözlü entüb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bilim, İspanyolca Bakanlığı gelen hibe AGAUR fonlar için NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER ve 2014SGR-345 AGAUR) ve Avrupa Komisyonu tarafından desteklenmiştir. RT AGAUR (İspanya), JJ bir önceden Doktora Bursu Doktora Bursu Çin burs Konseyi (Çin) tarafından desteklenen ve NR Ramon y Cajal programı (RYC-2010-06210, 2010, MINECO) tarafından desteklenen tutar. Biz Dr Torrealba protein üretim, “Servei de Microscopia” dan i. Barba uzman önerileri için teşekkür ederiz ve Dr. M. Costa Universitat Autònoma de Barcelona yararlı teknik destek için “Servei de Citometria” dan.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
Referências
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biologia. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
