Изображений взаимодействия клеток в слизистой оболочки трахеи во время инфекции вируса гриппа с помощью двух Фотон прижизненной микроскопии
Summary
В этом исследовании мы представляем протокол для анализа двух Фотон прижизненной изображений и ячеек взаимодействия в мышиных слизистой оболочки трахеи после заражения вирусом гриппа. Этот протокол будет актуален для исследователей, изучения динамики иммунных клеток во время инфекции дыхательных путей.
Abstract
Анализ ячеек или ячеек возбудитель взаимодействия в естественных условиях является важным инструментом для понимания динамики иммунной реакции на инфекции. Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) позволяет наблюдения взаимодействий клеток в глубоких тканях живых животных, при сведении к минимуму Фотообесцвечивание, созданные во время захвата изображений. На сегодняшний день, были описаны различные модели для 2P-IVM лимфоидных и не лимфоидных органов. Однако томография органов дыхания остается проблемой из-за движения, связанных с циклом дыхания животных.
Здесь мы описываем протокол для визуализации в vivo иммунных клеток взаимодействий в трахею мышей, инфицированных вирусом гриппа, используя 2 P-КБПБ. С этой целью мы разработали пользовательские изображений платформы, которая включала хирургического воздействия и интубация трахеи, после приобретения динамических изображений нейтрофилов и дендритных клеток (DC) в эпителии слизистой оболочки. Кроме того мы подробно шаги, необходимые для выполнения гриппа интраназального инфекции и потока гранулярных анализ иммунокомпетентных клеток в трахею. Наконец мы проанализировали нейтрофилов и DC моторики, а также их взаимодействия в ходе фильма. Этот протокол позволяет для создания стабильных и яркие изображения 4D необходимое для оценки взаимодействия ячеек в трахею.
Introduction
Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) является эффективным методом для реального времени изображений к ячейке взаимодействий, как они происходят в их природной среды1. Одним из главных преимуществ этого метода является, что она позволяет изучение клеточных процессов на большей глубине образца (500 мкм до 1 мм) по сравнению с другими традиционными изображений методы2. В то же время использование двух низкой энергии фотонов, порожденных два фотона лазерного минимизирует фото повреждение тканей, обычно связанных с процессом приобретения изображения2. В течение последнего десятилетия 2P-IVM был применен для изучения различных типов взаимодействий ячеек в нескольких дисциплинах3,4,5. Эти исследования были особенно важны для расследования иммунные клетки, которые характеризуются их высокая динамичность и формирование известных контактов после сигналов другие клетки и окружающей среды. 2P-IVM также применяется для изучения взаимодействия между возбудителя и принимающих6. Действительно было ранее показано, что некоторые патогены могут изменить тип и продолжительность контактов между иммунных клеток, препятствуя, в результате иммунного ответа7.
На слизистую оболочку дыхательных путей это первый сайт, в котором иммунный ответ против бортовых патогенов сгенерированное8. Таким образом в естественных условиях анализ взаимодействий возбудителя хост в этой ткани очень важно понять начало механизмов обороны хост во время инфекции. Однако 2P-IVM дыхательных путей является сложной задачей, главным образом благодаря артефакты, производимые цикл дыхания животного, которое подрывает процесс приобретения изображений. Недавно были описаны различные хирургические модели для визуализации мышиных трахеи9,10,11,легких и12 13,14,15, 16. Трахеи 2P-IVM модели представляют отличную set-up визуализировать на начальном этапе иммунной реакции в верхних дыхательных путях, в то время как модели 2P-IVM легких альвеолы больше подходят для изучения поздней фазе инфекции. Модели развитых легких представляют ограничения, связанные с присутствием альвеол заполненными воздухом, которые ограничивают оптических проникновения лазерных и сделать недоступными для в vivo imaging17 слизистая слой внутрилегочного airways . И наоборот структура трахеи, образованное непрерывного эпителия, облегчает получение изображения.
Здесь мы представляем протокол, который содержит подробное описание шагов, необходимых для выполнения инфекции гриппа, хирургической подготовки животных, а также 2P-IVM трахеи. Кроме того мы описывают конкретные экспериментальные установки для визуализации нейтрофилов и дендритных клеток (DC), два типа иммунных клеток, которые играют важную роль в качестве посредников механизм обороны против гриппа вирус18,19 . Наконец мы описываем процедуры для анализа взаимодействий нейтрофилов DC. Было показано, что эти контакты модулировать DC активации и, впоследствии, чтобы повлиять на иммунный ответ против патогенов20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа представляет подробный протокол для поколения 4D изображения показаны миграции восприимчивую передаваемых нейтрофилов и их взаимодействия с DC во время инфекции гриппа в мыши трахеи. Описанные 2P-IVM модель будет отношение к изучению динамики иммунных клеток во время инфекции …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана швейцарского национального фонда (СНФ) гранты (176124, 145038 и 148183), Грант реинтеграции Мари Кюри Европейской Комиссии (612742) и SystemsX.ch на грант для D.U.P. (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
Referências
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
