Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões
Summary
Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.
Abstract
A análise da célula-célula ou célula-patógeno interação na vivo é uma ferramenta importante para compreender a dinâmica da resposta imune à infecção. Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) permite a observação das interações célula no tecido profundo em animais vivos, minimizando o fotobranqueamento gerado durante a aquisição de imagens. Até à data, têm sido descritos diferentes modelos para 2P-IVM dos órgãos linfoides e não linfoides. No entanto, a imagem de órgãos respiratórios permanece um desafio devido ao movimento associado com o ciclo de respiração do animal.
Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar na vivo celular imune interações na traqueia de camundongos infectados com o vírus da gripe usando 2P-IVM. Para este fim, nós desenvolvemos uma plataforma de imagem personalizada, que incluía a exposição cirúrgica e intubação da traqueia, seguida pela aquisição de imagens dinâmicas de neutrófilos e células dendríticas (DC) no epitélio da mucosa. Além disso, nós detalhados os passos necessários para realizar a gripe intranasal infecção e fluxo cytometric análise de células do sistema imunológico na traqueia. Finalmente, analisamos neutrófilos e motilidade DC, bem como suas interações no decurso de um filme. Este protocolo permite a geração de imagens de 4D estável e brilhante necessário para a avaliação de interações célula-célula na traqueia.
Introduction
Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) é uma técnica eficiente para tempo real de imagens de célula para célula interações que ocorrem em seu ambiente natural1. Uma das principais vantagens deste método é que permite o estudo de processos celulares em uma maior profundidade de amostra (500 µm a 1 mm) comparado com outros tradicionais de técnicas de imagem2. Ao mesmo tempo, o uso de dois fótons de baixa energia gerada pelo laser dois fotões minimiza o foto-dano no tecido normalmente associado com o processo de aquisição de imagem2. Durante a última década, 2P-IVM foi aplicada para estudar diferentes tipos de interações célula-célula em várias disciplinas,3,4,5. Estes estudos foram especialmente relevantes para investigar as células imunes, que caracterizam-se pelo seu elevado dinamismo e a formação de contatos proeminentes seguindo os sinais gerados por outras células e o meio ambiente. 2P-IVM foi também aplicada para estudar as interações entre patógeno e hospedeiro6. Com efeito, anteriormente mostrou que alguns patógenos podem alterar o tipo e a duração dos contatos entre células do sistema imunológico, dificultando, assim, a resposta imune7.
A mucosa das vias aéreas é o primeiro site no qual a resposta imune contra patógenos no ar é gerado por8. Portanto, na vivo análise das interações patógeno-hospedeiro, este tecido é fundamental entender a iniciação dos mecanismos de defesa do hospedeiro durante a infecção. No entanto, 2P-IVM das vias aéreas é um desafio, principalmente devido os artefatos produzidos pelo ciclo de respiração do animal, que compromete o processo de aquisição de imagem. Recentemente, diferentes modelos cirúrgicos foram descritos para imagiologia murino traqueia9,10,11,12 e pulmões13,14,15, 16. 2P-IVM traqueal modelos representam um excelente set-up para visualizar a fase inicial da reação imune nas vias aéreas superiores, enquanto os alvéolos pulmonares 2P-IVM modelos são mais adequados para estudar a fase final das infecções. Os modelos de pulmão desenvolvidos apresentam uma limitação associada à presença de alvéolos cheios de ar, que restringir a penetração ótica do laser e fazer com que a camada da mucosa das vias aéreas intrapulmonares inacessíveis na vivo de imagem17 . Por outro lado, a estrutura da traqueia, formada por um epitélio contínuo, facilita a aquisição de imagens.
Aqui, apresentamos um protocolo que inclui uma descrição detalhada das etapas necessárias para realizar a infecção da gripe, preparação cirúrgica dos animais e 2P-IVM da traqueia. Além disso, descrevemos uma montagem experimental específica para a visualização de neutrófilos e células dendríticas (DC), dois tipos de células imunes que desempenham um papel importante como mediadores do mecanismo de defesa contra vírus de gripe18,19 . Finalmente, descrevemos um procedimento para analisar interações de neutrófilos-DC. Estes contactos foram mostrados para modular a ativação DC e, posteriormente, para afetar as respostas imunológicas contra patógenos20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para a geração de imagens de 4D, mostrando a migração de neutrófilos enviaram transferidos e suas interações com DC durante uma infecção de gripe na traqueia do mouse. O modelo descrito 2P-IVM será relevante para estudar a dinâmica de células imunes durante uma infecção nas vias aéreas.
Recentemente, vários modelos com base na visualização da dinâmica celular das vias aéreas têm sido desenvolvidos9…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da Fundação Nacional Suíço (SNF) (176124, 145038 e 148183), o Europeu Comissão Marie Curie reintegração Grant (612742) e o SystemsX.ch de uma subvenção para D.U.P (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
Referências
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